Меню Закрыть

Незамерзайка состав какой должен быть: Состав незамерзающих жидкостей для авто

Содержание

Из чего должна состоять не ядовитая незамерзайка

Автор Андрей На чтение 3 мин. Просмотров 361 Опубликовано

От ядовитых незамерзаек болит голова, слезятся глаза и притупляется внимание. Салон машины они превращают в газовую камеру. Несколько советов автолюбителям о том, как отличить безобидную химию от подкапотной мины. Каков состав хорошей незамерзайки?

Любая стеклоочистительная жидкость содержит два главных компонента: воду и спирт. Именно спирт не дает воде замерзнуть и помогает удалить грязь со стекол. Он может быть этиловый, изопропиловый или метиловый. Последний запрещен, так как его пары опасны для здоровья. В салон машины они попадают через воздухозаборники.

Первые отравления метанолом случились из-за употребления знаменитого тройного одеколона. Его придумали в 1910 году на одной из московских парфюмерных фабрик. По одной из версий свое название одеколон получил благодаря тройной очистке вредного метилового спирта.

Копеечный парфюм моментально стал популярным у любителей горячительных напитков и домохозяек. Он отлично отмывал оконные стекла и зеркала.

Как же действуют на водителя ядовитые пары? Если залить запрещенную незамерзайку с метиловым спиртом, то уже минут через 5 езды наблюдаются первые симптомы: у водителя начинает болеть голова, повышается артериальное давление.

Еще через полчаса головная боль усиливается, в горле начинает першить, глаза слезятся. При этом посторонних запахов в салоне автомобиля не чувствуется. Еще через 20 минут езды становится совсем паршиво, внимание рассеяно. Такое ощущение, что пьян или сильно уставший. Лучше остановится от греха подальше.

Производство метаноловых жидкостей в России запрещено. Метиловый спирт – сильнейший яд. Выпив всего пол чайной ложки, человек получит сильнейшее отравление, а столовая ложка уже смертельная доза.

Визуально отличить, запрещенная это жидкость или хорошая незамерзайка, практически невозможно. Даже запах у них примерно одинаковый. Чтобы вода не замерзала в тридцатиградусный мороз достаточно всего одной трети метанола. К тому же он самый дешевый из спиртов. Именно поэтому метаноловые незамерзайки до сих пор в продаже.

Пары изопропилового спирта практически безвредны. Самые лучшие незамерзайки производят на основе этилового спирта, но и стоят они значительно дороже.

Теперь вы знаете про состав хорошей незамерзайки. А головная боль, слезящиеся глаза, першение в горле – это реакция организма на отраву, которая находится под капотом. Немедленно слейте такую незамерзайку. Экономия на здоровье обходится очень дорого!

Видео

Рекомендации по эксплуатации и другие советы автолюбителям:

Оцените статью: Поделитесь с друзьями!

Правила выбора незамерзающей жидкости для стеклоочистителя. Виды и состав хорошей незамерзайки

Выбор незамерзайки для авто в зимнее время года должен основываться на минимальной температуре ее замерзания, составе, эффективности, качестве и цене. Лучшие зимние стеклоомывающие жидкости сделаны на основе изопропилового спирта (изопропанола), при этом они имеют резкий специфический запах, который зачастую отпугивает автовладельцев. И наоборот, поддельные средства, не имеющие запаха, зачастую выполняются на основе метанола, являющегося ядом для человеческого организма. Кроме этого, эффективность поддельных незамерзаек гораздо ниже, чем у официальных.

Содержание:

Состав незамерзайки

Чтобы правильно определиться с тем какую незамерзайку лучше покупать, в первую очередь необходимо ознакомиться с ее составом. Как правило, он указывается непосредственно на этикетке упаковки (канистры). Естественно, при условии, что средство не поддельное, но этот вопрос будет рассмотрен немного ниже.

Состав лучших незамерзаек обычно состоит из изопропилового спирта (изопропилен), воды, моющих средств (поверхностно активных веществ — ПАВ), этиленгликоля. В редких случаях в состав могут быть добавлены дополнительные компоненты, например, ароматизаторы. Упомянутый изопропиловый спирт официально разрешен для использования при производстве стеклоочистительных жидкостей для использования зимой, так как абсолютно безвреден для человеческого организма. Его единственный недостаток — специфический «спиртовой» запах.

Некоторые производители незамерзаек выпускают свою продукцию на основе не изопропилового, а этилового спирта. Его также допускается использовать без вреда для здоровья. Но в последнее время незамерзайки на основе этилового спирта встречаются реже, поскольку их запретили по причине употребления его в качестве алкогольных напитков да и стоят они гораздо дороже. Такую спиртовую незамерзайку разве что сами делают залив в бачок стеклоомывателя бутылку водки, но тогда могут возникнуть вопросы у службы ГАИ.

Соответственно, при выборе лучшей незамерзайки при возможности необходимо не только осмотреть упаковку и ознакомится с составом, а и понюхать ее. Только делать это нужно осторожно, лишь принюхиваясь, а не «на полную грудь»! Если незамерзайка без запаха, то, скорее всего, она сделана на заменителе изопропилена — метаноле (метиловый спирт). Метанол очень вреден для человеческого организма, в частности, он негативно влияет на мозг, а также может привести к проблемам со зрением. Причина использования метанола при производстве незамерзаек банальна — его низкая цена в сравнении с изопропиленом.

Вдыхание паров, образующихся в результате использования стеклоомывающей жидкости, происходит через вентиляционные каналы. Через них пары попадают в салон, где вдыхаются водителем и пассажирами. Поэтому выбор основы незамерзайки чрезвычайно важен.

Некоторые зимние стеклоомывайки, не имеющие запаха, могут быть сделаны не на метаноле. Однако лабораторные исследования таких средств указывают, что в их составе, как правило, содержатся другие вредные для человека вещества. Поэтому от покупки не пахнущих незамерзаек лучше воздержаться!

Хорошо, если в составе незамерзайки имеется этиленгликоль. Это химическое соединение предотвращает быстрое испарение спирта со стекла. Если это произойдет есть вероятность, что влага на стекле быстро превратится в тонкий слой льда. Однако это хорошо при значительных минусовых температурах. Если же этиленгликоля в незамерзайке много, то это может привести к помутнению жидкости при небольших минусовых температурах вплоть до того, что она не сможет проходить через форсунки стеклоомывателя.

Что касается ароматизаторов, то обычно производители добавляют в состав незамерзаек различные химические составы с фруктовыми вкусами — например, яблоко, апельсин и так далее. Это позволяет скрасить неприятный спиртовой запах при использовании зимней стеклоомывающей жидкости. Однако необходимо понимать, что запах от такой омывайки испаряется за считанные секунды. А для поддержания приятного запаха в салоне используются специальные ароматизаторы в машину.

В состав большинства незамерзаек входят красители. Именно благодаря им средства приобретают свой цвет — синий, зеленый и так далее. Эти средства химически нейтральны и никак не влияют на свойства незамерзающей омывающей жидкости. Поэтому и выбор в данном случае неважен, разве что для эстетов. Однако следует избегать откровенно темных оттенков (например, темносиних), поскольку это, во-первых, затрудняет визуальный контроль за состоянием жидкости, а во-вторых, использование сильно окрашенных незамерзаек приводит к снижению ресурса трубок, насоса и форсунок системы стеклоомывателя.

Приблизительное объемное соотношение перечисленных компонентов, входящих в состав стандартной незамерзайки:

  • изопропиловый спирт — 60%;
  • вода — 39%;
  • пропиленгликоль — 0,9%;
  • моющие средства — 0,1%;
  • ароматизаторы и красители — по усмотрению производителя.

Свойства стеклоомывающей жидкости

Свойства зимних жидкостей омывания стекол будут влиять на температуру замерзания и обзорность дороги. Так как плохая незамерзайка оставляет разводы либо быстро образовывает наледь по углам стекла.

Минимально допустимая температура использования

При выборе незамерзайки для авто важно учитывать ее физические и химические свойства. Так, первым важным фактором при выборе незамерзайки является минимально допустимая температура использования. Ее значение обычно указывается на этикетке. Температура замерзания жидкости напрямую зависит от концентрации спирта в составе. Соответственно, чем его больше — тем температура замерзания ниже.

При выборе того или иного средства необходимо руководствоваться информацией о том, при каких условиях (температурном диапазоне) предполагается использовать машину. Однако лучше брать с запасом на 5…10°С ниже. Например, если вы знаете, что минимальная температура в вашем регионе в ближайшее время будет около –15°С, то лучше взять стеклоомывающую жидкость с минимально допустимой температурой использования, составляющую около –20°С и ниже. Это обусловлено тем, что некоторые производители банально экономят на спирте, и соответственно, реальная температура замерзания будет несколько выше, чем заявленная на упаковке.

При использовании омывающей жидкости для стеклоомывателя в условиях очень низких температур имеет смысл покупать не готовые средства, а концентрат. Многие производители выпускают свою продукцию именно в таком виде. Обычно они реализуются в канистрах больших объемов, а в составе средства имеется повышенное содержание спирта и других компонентов. Для приготовления готовой незамерзайки достаточно развести концентрат с водой (лучше если она будет дистилированой). При этом на упаковке или в прилагаемой инструкции указываются рекомендуемые объемы и пропорции, подходящие для конкретного диапазона температуры окружающего воздуха. Использование концентрата зачастую более выгодно и с экономической точки зрения, поскольку большой объем средства при использовании в долгосрочной перспективе обойдется дешевле.

Безопасность

При выборе той или иной омывающей жидкости для лобового стекла важно выбирать средства, которые безопасны для лакокрасочного покрытия автомобиля, резиновых и пластиковых деталей, не оставляют разводов и пятен на стекле, эффективно удаляют грязь со стекла. Что касается эффективности, то важно, чтобы зимняя незамерзайка позволяла качественно удалить с поверхности соль и прочие химические реагенты, которыми в зимнее время посыпают дороги. При использовании стеклоомывающей жидкости при плюсовой температуре окружающего воздуха (например, при потеплении или в межсезонье) она должна хорошо отмывать грязь и различный мелкий мусор со стекла. Информацию о безопасности и эффективности обычно прямо указывается на этикетке канистры.

Как проверить хорошая ли незамерзайка

Важно проверить, что собой представляет незамерзайка — раствор или смесь. В идеале она должна представлять собой раствор. Так, для проверки нужно в морозную погоду нанести небольшое количество жидкости на стекло. Если незамерзайка качественная (то есть, представляет собой раствор), то она останется жидкостью, стекая со стекла без следов. Если же состав представляет собой смесь, то в таком случае незамерзающие компоненты быстро испаряются, а на стекле останется вода, которая за короткий промежуток времени превратится в лед либо будут видны потеки.

Можно проверить качество незамерзайки в домашних условиях. Для этого нужно взять небольшое количество жидкости (грамм 200…300) и поместить ее в морозильную камеру холодильника, температура в которой должна быть порядка –20°С. Время испытания от двух часов и более. В идеале омывающая жидкость не должна превратится в ледообразную кашицу, а тем более замерзнуть.

Еще несколько коротких советов по выбору незамерзайки по упаковке:

  • Рекомендуется приобретать омывающую жидкость в прозрачной канистре, поскольку так можно визуально осмотреть состояние средства.
  • При осмотре канистры не взбалтывайте жидкость сразу, вместо этого осмотрите дно упаковки снизу, на его поверхности не должно быть никаких твердых частиц и/или отложений.
  • Обратите внимание на дату изготовления. Не стоит покупать средство, срок изготовления которого составляет от одного года и более. Существует вероятность, что такие незамерзайки частично или полностью потеряли свои свойства. Особенно это касается недорогих составов.
  • Возьмите канистру в руки и хорошенько взболтайте ее содержимое. Если омывающая жидкость более-менее качественная, то на ее поверхности в результате встряски образуется пена. И чем ее будет больше — тем лучше. Наличие пены говорит о том, что в составе незамерзайки имеется достаточное количество поверхностно активных веществ, то есть, чистящих средств. Однако эта пена должна достаточно быстро рассосаться, поскольку длительное наличие пены указывает на низкое качество незамерзайки.
  • При визуальном осмотре жидкости нужно обратить внимание на состояние омывающей жидкости. Так, она не должна быть мутной. Хорошо, если покупка происходит на морозе (например, при температуре около –20°). В этом состоянии можно визуально оценить ее агрегатное состояние (она не должна стать тягучей, а тем более замерзнуть), а также в ней не должно быть льдинок.

Концентрацию спирта в незамерзайке, а значит и приблизительную температуру замерзания, можно выяснить с помощью традиционного спиртометра, используемого в пищевой промышленности. Он представляет собой поплавок, который опускают в спиртовой раствор. По мере того, насколько глубоко он погрузился, можно судить о концентрации спирта в растворе.

Алгоритм проверки следующий… Корпус спиртометра проградуирован числами от 0 до 100. Например, значение 20 соответствует 20% содержанию чистого этилового спирта в воде. Однако поскольку плотность изопропилового, этилового и метилового спиртов отличаются незначительно, то с помощью спиртометра можно проверять незамерзайки на основе любого из них. Дело в том, что недобросовестные производители могут сэкономить на спирте, и соответственно, минимально допустимая температура использования незамерзайки будет выше, чем указанная на упаковке. Именно поэтому желательно для проверки использовать спиртометр который позволит определить процент концентрации спирта.

Далее представлена таблица, в которой сведена информация о показателях спиртометра для различных типов спиртов и температуры замерзания соответствующих растворов.

Температура замерзания, градусы ЦельсияДоля спирта, %
ИзопропиловыйЭтиловыйМетиловый
–10241915
–15302520
–20453025
–25553430
–30653933

Зачастую дешевые спиртометры не отличаются точностью показаний, поэтому надо использовать либо более точные спиртометры, либо пользоваться ими «на глаз».

Показания рефлектометра при проверке температуры замерзания жидкости

В лабораторных условиях для такой цели используют рефлектометр. Подобный недорогой прибор можно приобрести и для использования дома, в том числе для проверки других технологических жидкостей в автомобиле и быте.

Обратите внимание, что незамерзайки без запаха не всегда выполняются на основе метанола. Выявление этого спирта проводится, в основном, в лабораторных условиях нагрев его до 80 градусов и поместив в специальный анализатор. В повседневной жизни метанол можно обнаружить, если разогретую медную проволоку поместить в испытуемую жидкость. В процессе химической реакции метанола с горячей медью будет образовываться формальдегид, который легко определить просто на запах. Поэтому чаще всего прибыль на дешевой незамерзающей стеклоомывающей жидкости получают из-за того что попросту разбавляют хорошую.

Выбор по упаковке

Форма и объем упаковок, естественно, отличаются от производителя к производителю. Однако есть несколько нюансов, позволяющих выбрать не только более качественную незамерзайку, но и минимизировать шансы на покупку подделки. Так, обычно в небольших ПЭТ-бутылках реализуются бюджетные средства с низким качеством действия. Стоят они недорого, однако и большого эффекта от них ждать не стоит. Кроме этого, это может быть и подделка на основе метанола.

И наоборот, производители, которые выпускают качественную продукцию, стараются заботиться о покупателях, поэтому реализуют жидкости в удобных канистрах с ручками, а иногда в комплекте с канистрой предусматривается и лейка. Еще существует упаковка в виде ПЭТ-пакетов. Обратите внимание, что подобные упаковки достаточно хрупкие и могут повредиться при ударе или даже незначительном механическом воздействии. Поэтому пакеты лучше не возить с собой в машине, а оставлять в гараже.

Следующее, на что стоит обратить внимание — качество как самой канистры, так и этикетки. Обычно в некачественной канистре реализуется и некачественная (а то и вовсе поддельная) омывающая жидкость. Стенки канистры должны быть достаточно толстыми. Зачастую поддельные или контрафактные незамерзайки фасуют в канистры с тонкими стенками, которые прогибаются при малейшем механическом воздействии.

Сама этикетка должна быть качественно приклеена к корпусу канистры. Если перед вами канистра с незамерзайкой, на этикетке которой написано глупое или несоответствующее название, а дизайн сделан дешево или неуместно, то средство, скорее всего будет малоэффективным или поддельным. Единственный недостаток таких незамерзаек — низкая цена.

Спрашивайте в комментариях. Ответим обязательно!

какой спирт должен быть – три типа

О спирте, который должен быть в незамерзающей жидкости для омывателя автомобиля, сложено немало мифов: один ядовит, второй замерзает, третий пьянит. Так какой на самом деле должен быть спирт в незамерзайке?

Есть три спирта, которые можно использовать в незамерзающей жидкости для омывателя – в смеси с водой и ароматизаторами. Собственно, все они и используются производителями, причем иногда в одной жидкости есть два вида спиртов.

От типа спирта, который есть в основе незамерзайки, в морозы зависит чистота стекла, а еще – аромат в салоне

Этиловый спирт (этанол)

Данный продукт известен также как пищевой или медицинский спирт. В качестве основы для омывайки он хорош всем: наименее вреден для организма, обладает высокими моющими свойствами, не теряет текучести при сильном морозе.

Также интересно: Сколько градусов должна быть незамерзайка

Это самый распространенный из спиртов в нашей стране, и в отличие от других стран, у нас он один из самых дешевых. В крайнем случае не исключено использование вместо незамерзающей жидкости этанола домашнего приготовления – самогона. Конечно, годится и водка фабричного производства.

Изопропиловый спирт (изопропанол)

Именно из этого спирта изготавливают абсолютное большинство жидкостей, которые поступают в официальную продажу в Украине. Между тем, у изопропанола есть существенные недостатки: имеет худшие во всей тройке моющие свойства, вреден для человека, а самое главное – на морозе он густеет, (не кристаллизуется, а именно густеет – меняет плотность). Это очень важно для автомобилей с новомодными форсунками маленького диаметра, которые распыляют жидкость тонким веером – когда совсем холодно, изопропиловая омывайка не достает до лобового стекла.

Современные форсунки, распыляющие жидкость веером, более всего чувствительны к плотности незамерзайки на морозе

Метиловый спирт (метанол)

Этим спиртом давно пугают людей – мол, ядовит настолько, что как минимум можно потерять зрение. Правда, надо добавить: если выпить 10 граммов. Интересно, что если выпить изопропиловый спирт, результат будет примерно тот же. Но остальные качества метанола как специально подобраны для его “работы” в качестве омывайки: имеет высокие моющие свойства, не имеет неприятного запаха, не густеет на морозе и стоит откровенно дешево.

Также интересно: Незамерзайка для авто: можно ли залить в бачок спирт или водку

Что интересно, пары метанола менее токсичны, чем пары изопропанола: предельно допустимой концентрации в салоне последний достигает за 5 – 10 секунд, а метанол – за 300 секунд. Однако, в легальных незамерзающих жидкостях в Украине не используется, причина – высокая токсичность при употреблении внутрь организма. Тем не менее, в развитых странах с холодным климатом именно метиловый спирт является основой жидкостей для омывателя лобового стекла.

Как видим, получается, что метиловый спирт наиболее удобен для использования его в качестве основы незамерзающей жидкости для омывателя. Но в реальности все наоборот: обычно производители берут за основу изопропиловый спирт – тот, что наименее пригоден для этого.

Метиловый спирт, несмотря на недобрую славу, имеет наилучший комплекс характеристик для “работы” в качестве незамерзайки.

Рекомендация Авто24

По большому счету, автомобилисту должно быть безразлично, на какой основе сделали омывайку, плещущуюся в бачке под его капотом. Принципиальных отличий между всеми тремя спиртами нет ни в плане безопасности для организма, ни в плане эффективности. Есть разве что один нюанс насчет изопропанола – при сильном морозе он становится гуще, и заметно теряет текучесть уже при – 15оС. Но если вы живете не на севере страны, для вас это вряд ли будет иметь значение. Ну а поскольку наилучший баланс характеристик имеет метанол, в идеале было бы использовать именно его.

ТАКЖЕ ИНТЕРЕСНО: Как выбрать незамерзайку: мифы и правда о метанол

Из чего сделана незамерзайка

Не секрет, что далеко не каждый автолюбитель знает полный химический состав Незамерзающей жидкости, которую он регулярно заливает в бочек омывателя почти каждый день в зимнюю пору. Как правило все его, знания заканчиваются на том, что какую-то незамерзайку изготавливают из каких-то спиртов. Иногда даже бытуют заблуждения, что крепость и качество незамерзайки зависят от глубины цвета или же пенистости жидкости, что зеленная выдерживает морозы выше, чем синяя, что дорогая изопропиловая безопаснее, дешевой на дороге и прочие…

Из чего сделана незамерзайка

В настоящее время российским законодательством регулируется лишь один элемент химического состава незамерзающей жидкости и это действительно спирт, он должен быть изопропиловым, а не метиловым.

Незамерзающая жидкость помимо спиртов содержит поверхностно-активные вещества, которые используются в качестве моющих средств. Именно этот компонент способствует хорошей очистке от различных природных загрязнителей, а также от хим реагентов и песка, в обилие присутствующих на зимней дороге.

Еще одним неотъемлемым компонентом в  незамерзайке являются различные ароматизаторы и отдушки. В основном их используют в незамерзающей жидкости из изопропилового спирта, для того что бы смягчить или перебить невыносимый, едкий запах. Следующий компонент, это краситель, здесь стоит отметить, что кроме обычного химического красителя используют пищевой краситель, применяемый во многих продуктах питания. Выбирая незамерзающую жидкость стоит обратить внимания на глубину цвета, вить слишком темная незамерзайка, насыщенного ядерного цвета сама может стать причиной загрязнения автомобиля, особенно это хорошо заметно по налету на бочке и при попадании такой незамерзайки в щели.

Последним, и одним из основных компонентов, входящих в состав жидкости для омывания стекол, является вода. Однако далеко не каждую воду можно использовать в производстве.При производстве качественной и химически стабильной незамерзающей жидкости возможно использовать воду, которая прошла полный цикл фильтрации от механических фракций и солей. Вить обычная водопроводная вода может стать причинной выпадения осадка в стеклоомывателе и дальнейшего повреждения и загрязнения фарсунков. В  ходе использования полученной таким образом незамерзающей жидкости возможно появление совсем ненужных царапин на стеклах автомобиля. Покупайте только качественную и сертифицированную продукцию!

Какой процент спирта в Незамерзайке?

Спирт от 25 до 75% ПАВ – 1% Денатурирующее вещество – 0,5% Краситель – 0,001%

Чего не должно быть в Незамерзайке?

Метанол (метиловый спирт)

Такие незамерзайки имеют малую цену, высокую температуру замерзания, но у них есть существенный недостаток. В России применение метаноловых незамерзающих жидкостей запрещено, в отличие от стран Европы. Потому, что метиловый спирт опасен для здоровья, если принять внутрь.

Сколько метанола в Незамерзайке?

Тогда главный санитарный врач страны Геннадий Онищенко мотивировал запрет случаями отравления при приеме незамерзайки вместо пищевого алкоголя. Концентрация метилового спирта в канистре омывайки составляет примерно 40%, то есть в пятилитровой емкости содержится около 2 литров или 1500 граммов метанола.

Как по другому называется незамерзайка?

омывайка, незамерзающая жидкость, незамерзайка жидкость, предназначенная для уд … Википедия Метанол — Метанол … Википедия

Как сделать незамерзайку из спирта?

Подойдет любой этанол: это может быть медицинский спирт или средство для мытья окон на основе этилового спирта (посмотрите состав на этикетке). Пропорции незамерзайки должны быть 1:2 (1 часть спирта, 2 части воды). Потом добавляем столовую ложку стирального порошка и очень хорошо перемешиваем. С использованием уксуса.

Сколько изопропилового спирта в Незамерзайке?

Чтобы омывающая жидкость гарантированно не застывала при −30ºС, она должна содержать либо 40% этилового спирта, либо 50% изопропилового, либо 34% метилового спирта. То есть в 5-литровой баклаге «незамерзайки» должно присутствовать либо 2 литра этилового спирта, либо 2,5 изопропилового, либо 1,7 литров метилового.

Какая самая лучшая незамерзайка?

Рейтинг «незамерзаек» 2020

  • Liqui-Moly Antifrost Scheiben-Frostschutz. Открывает наш рейтинг немецкая марка. …
  • Ultrafroz Polar Express. …
  • Sapfire Windshield Washer. …
  • Nord Stream. …
  • CoolStream. …
  • Nord Star. …
  • North Drive. …
  • Чистая миля

Как узнать есть ли метанол в Незамерзайке?

Проверить наличие метанола в незамерзайке можно с помощью медной проволоки. Нагреваем ее зажигалкой, и опускаем в жидкость. Если пахнет уксусом — значит есть метанол.

Какой вкус у метанола?

По физическим свойствам (вкус, цвет, запах) метанол похож на этиловый спирт. … Если в сосуде — метиловый спирт, вы почувствуете сильный резкий неприятный запах формальдегида. Этанол в этом случае никаких запахов не дает.

Сколько стоит 1 литр метанола?

Метанол. Фасованный и наливом в тару потребителя (канистры, бочки, кубовые емкости). Цена за литр 39р.

Что входит в состав незамерзайки?

В состав любой незамерзайки входят спирт (чем его больше, тем ниже точка замерзания), вода, ПАВ (поверхностно-активные вещества), отдушка и краситель. Элементарно! Самый дорогой спирт – этиловый, этанол. Он применяется в медицине, его можно пить.

Почему добавление спирта в жидкость для омывателя лобового стекла предотвращает образование льда на стекле?

Изопропиловый спирт менее летуч, в результате на стекле образуется дольше испаряющаяся плёнка. Кроме того, у изопропанола значительно более резкий запах, практически не маскируемый отдушками, поэтому стеклоомыватели на его основе имеют более жесткие органолептические свойства.

Что такое незамерзайка жидкость?

Незамерзайка – это жидкость для обмывания ветровых стекол автомобиля в период холодов, представляющая собой концентрат из спиртов. В основном данное средство изготавливают с применением этилового спирта. … Такая жидкость имеет резкий запах, но низкую стоимость.

Как сделать незамерзайку в домашних условиях без спирта?

Например, чтобы сделать незамерзайку своими руками в размере 1,5 л, Вам нужно взять 0,5 л очистителя и добавить 1 л воды. У этого способа есть универсальная формула. Необходимо, взять 3,25 литра воды, дополнить туда столовую ложку средства для мытья посуды.

Как сделать незамерзайку с приятным запахом?

Изготовление недорогой незамерзайки своими руками

Добавляем пару капель жидкого мыла. Несколько раз прыскаем очистителем для стекл, это улучшит смывание и усилит моющий эффект. Закрываем бутылку и хорошенько перемешиваем. Данный состав обладает приятным ароматом, не источает резких запахов.

Чем можно заменить незамерзайку?

Чтобы поменять стеклоомывающую жидкость, нужно вынуть пробку из горловины бачка, затем залить незамерзайку до средины горловины.

Испытания «незамерзайки» — Портал о нефтехимической отрасли

Бобруйская лаборатория испытала 25 образцов стеклоомывателей, приобретенных в торговых объектах страны в течение октября и ноября 2018 года и установила многочисленные отклонения по составу от заявленного на этикетках, по показателям качества и безопасности  от фактических значений по температуре кристаллизации (замерзания) и самое главное – по показателям объемной доли содержания метилового спирта. 

Некоторые образцы содержали от 6 до 9 % метиловго спирта. По гигиеническим нормативам, принятым в Республике Беларусь, в России, а также во всех странах ЕАЭС содержание метилового спирта в стеклоомывающих жидкостях не должно превышать 0,05 объемных процентов. В 19 из 25 образцах норма содержания метанола превышена до 180 раз!!!

— Несмотря на то, что непосредственного контакта у «незамерзайки» и человека нет, ее пары способны доставить серьезные неприятности здоровью пассажиров и водителей авто. Как известно, метиловый спирт (метанол) – сильнейший яд, превышение его концентрации в составе стеклоомывателей ведет к превышению допустимой концентрации в воздухе салона автомобиля. Чтобы получить отравление, достаточно попадания паров метанола через кожу, слизистую, в дыхательные пути. Степень отравления зависит от соотношения веса человека и количества попадания в организм метанола, — говорит Сергей Бакун.

Перечень испытанных стеклоомывающих жидкостей, опасных для здоровья, Бобруйский завод биотехнологий представил в Министерство здравоохранения, органы санитарного надзора, Государственный комитет по стандартизации,  Министерство антимонопольного регулирования и торговли. Испытатели считают, что продукцию, не соответствующую нормативным правовым актам необходимо изъять из торговли.

Пока государственные органы изучают информацию и вырабатывают адекватные меры, сезон холодных и грязных дорог в самом разгаре, средства продолжают поступать в торговые точки в больших объемах и раскупаться автомобилистами.

Мы публикуем результаты исследования бобруйских биотехнологов, чтобы потребитель смог самостоятельно принять решение, какое стеклоомывающее средство купить.

Итак, по мнению экспертов бобруйской лаборатории, испытания успешно прошли:

 

-«Green Cool» стеклоомыватель межсезонный -5°С»

— Автомобильный стеклоомыватель «Блеск -4°С»

— Стеклоомывающая жидкость «Дальновид люкс -20°С зимний»

— Жидкость стеклоомывающая «Обзор зимний -20°С»

— Жидкость стеклоомывающая антиобледенительная для автомобилей «MegaZone» Зимняя -20»

— Стеклоомывающая жидкость «Дальновид люкс — 20°С зимний» 5л

— Стеклоомыватели  «Кругозор — 20°С, — 25°С, -30°С»

 

В перечень стеклоомывающих жидкостей, опасных для здоровья, по мнению экспертов бобруйской лаборатории, попали:

— «maXLANE блик-20 ЗИМА»

— «Блик-20» зимний

— «Cleon Woy» жидкость стеклоомывающая-30»

— « Glied Nano Formula-30»

— «ICE DRIVE»

-«Arctic Glied-30 C»

-«RedLine-30»

-«FrozOK-30C»

-«АЛМАZ -25C»

-«Winter Cold-30»

-«SNOW QUEEN-30C»

-«MAGIC ICE-30C»

-«GLIED EXPERT-30»

 

В торговые точки сети АЗС «Белоруснефти» весь товар попадает через централизованные закупки. Операторы признаются, что водители часто спрашивают совета при выборе и в основном просят тот, что меньше пахнет.

Артем Зима, и.о. начальника АЗС №23 РУП «Белоруснефть-Минскавтозаправка» (съезд с МКАД на проспект Победителей) говорит:

— На нашей АЗС в наличии всего две марки – белорусский «Кругозор» и литовский «MegaZone». Разница в цене минимальная. Есть копии сертификатов качества. Контрафакту попасть в сеть АЗС «Белоруснефти» не получится.

 

За 15 минут на АЗС четверо водителей покупают стеклоомывающую жидкость.

Елена берет «MegaZone» и говорит, что предпочтет товары из Евросоюза.

Николай Степанович выбирает тот, что «помогает, а не замерзает на ходу» и признается, что его не беспокоят сильные запахи жидкости, а марки он не запоминает.

Опытный водитель Алексей

Если больше одной марки (представлено в продаже) – выбираю по цене. Дома, в Минске, покупаю только на АЗС или в супермаркетах, думаю, что продавец гарантирует качество. А вот в России приходилось останавливаться на трассе. Нормальная попалась незамерзайка, повезло.

Артем берет белорусский «Кругозор» и уверен, что в сети АЗС ему предложат только качественный товар. Ведь «Белоруснефть» дорожит репутацией.

 

Централизованные закупки товара – путь, гарантирующий качество. По этому принципу работают все крупные сети АЗС. Одна из российских сетей в Беларуси продает стеклоомывающую жидкость только под собственным брендом. В таком случае сеть должна максимально доверять производителю.

Заместитель начальника АЗС «Газпромнефть» № 24 Наталья Батурчик рассказывает, что для выбора производителя был проведен тендер, по результатам которого стеклоомывающую жидкость для сети производит Бобруйский завод биотехнологий.

 

Сеть белорусского оператора в Минске предлагает водителям две марки стеклоомывающей жидкости: «Алмаз», производства Гродненского ликеро-водочного завода и «MegaZone». Документы в порядке. Водители покупают незамерзайку, заливают и уезжают.

Сертификаты здесь никто не спрашивает. Доверие к сетям АЗС?

Проверим других продавцов.

На МКАД в районе Чижовки пирамиды из пластиковых бутылей с голубой жидкостью видны издалека днем и подсвечены вечером. Работа кипит. За 15 минут проданы больше 10 «незамерзаек». Клиентов здесь любят — водитель может даже не выходить из машины. Охотно расскажут про запах «как у жвачки», про то, что «пацаны морозили, минус 25 держит без проблем». Да и цена в два-два с половиной раза ниже, чем на АЗС. Правда, рассчитаться можно только наличными и сертификат «есть в офисе, но у хозяина несколько фирм, и я не знаю, в какой офис вам нужно ехать». А хозяин не отвечает. Наверное, на совещании.

Спрашиваем у покупателей: «Не боитесь? Здесь же может быть метиловый спирт – сильный яд!»

Водитель БМВ шутит, что после сварки аргона ему метанол не страшен.
Хозяин новенькой Лады уверен, что все «омывайки» одинаковые.
Суровый парень на Лексусе не понимает, зачем переплачивать, если здесь дешевле.
Молодой человек на Крафтере другой вариант не рассматривает, ведь ему одной бутылки хватает лишь на день. В масштабах месяца экономия серьезная. 

Во вред потенциального содержания метилового спирта покупатели здесь не очень верят. Больше ориентируются на температуру кристаллизации (замерзания) и надеются на теплую зиму.

Самым ответственным нам показался подход профессионального водителя, таксиста Сергея.

Он говорит, что поскольку проводит за рулем основную часть рабочего времени, эксперименты с расходными материалами, в том числе и со стеклоомывающей жидкостью, позволить себе не может. А потому доверяет советам тех, кто обслуживает его автомобиль. На станции техобслуживания проверяют сертификаты поставщиков и советуют продукцию Бобруйского завода биотехнологий.

Суммируя наше расследование, можно сделать следующие выводы:

 

  1. В составе «незамерзайки» допускаются только два основных ингредиента — этанол или изопропанол.  Учитывая высокую стоимость этилового спирта, изготовленная из него жидкость стоит дороже. Стоимость изопропанола еще выше. Если на  этикетке с дешевой стеклоомывающей жидкостью указан изопропанол, есть большая вероятность того, что лабораторный анализ покажет наличие метилового спирта.  Отличить жидкость с метанолом от жидкости на основе изопропанола или этанола можно  по цене, качественная жидкость дороже на 50-70%.
  2. Рекомендуем приобретать продукцию известных брендов и в проверенных местах, таких как сети АЗС. Жидкость с метанолом с большей долей вероятности можно встретить у коммивояжеров на обочинах магистралей. 
  3. Всегда следует владеть информацией о составе продукции и о степени риска при использовании опасных для здоровья средств по уходу за автотранспортом.
  4. Спасибо экспертам, которые могут предоставить исчерпывающую информацию широкой общественности.

Какого цвета «незамерзайку» лучше всего использовать зимой, и почему — Лайфхак

  • Лайфхак
  • Эксплуатация

Фото из открытых источников

Зимой в продаже появляются разномастные жидкости стеклоомывателя. У них разный цвет, и их продают в разных пластиковых банках и канистрах. Какую жидкость выбрать, чтобы не пожалеть о потраченных деньгах и не получить проблем со здоровьем, выяснял портал «АвтоВзгляд».

Начнем с того, что в состав любой «стеклоомывайки» должен входить спирт, иначе она замерзнет на морозе. Поэтому при производстве жидкости используют три вида спирта: изопропиловый, этиловый и метиловый. Их химические формулы близки, а вот свойства разные. Одни относительно безвредны, а другие могут лишить и жизни.

Не будем скрывать, что наши люди неравнодушны к алкоголю. Таких личностей очень привлекают спиртосодержащие составы. «Омывайка» — в их числе. Здесь заметим, этиловый спирт при небольшом принятии внутрь, можно считать относительно безопасным. Изопропиловый окажет негативное влияние на сердечно-сосудистую систему, а вот метиловый спирт — это яд. Выпив всего 10 мл такой жидкости, можно потерять зрение. Поэтому его использование в нашей стране запрещено. Вдыхать-то ее небезопасно, даже если и не пить…

Фото из открытых источников

Наиболее рентабельным при производстве стеклоомывателя выходит изопропиловый спирт, так как он неподакцизный. Именно такую продукцию можно легально купить в магазине. Из-за того, что у этого спирта едкий запах, производители добавляют в состав «незамерзайки» ароматизаторы и красители. У каждой компании они свои, вот поэтому и цвета у «омываек» получаются разные.

Принципиального различия между цветами нет. Все жидкости выполнят свое предназначение по очищению стекла. Поэтому в прицнипе можно использовать жидкость любого «колера», но тут есть нюанс. В бачок стеклоочистителя хорошо бы заливать жидкость такого цвета, чтобы она отличалась от цвета антифриза в системе охлаждения. Тогда, если в какой-то момент, вы увидите под машиной лужу, будете знать, что именно вытекло. Например, на морозе треснул бачок омывателя, или появилась брешь в системе охлаждения.

38469

38469

17 декабря 2020

33616


Состав среды для эффективного медленного замораживания линий эмбриональных клеток, полученных из морской медаки (Oryzias dancena)

Cytotechnology. 2016 Янв; 68 (1): 9–17.

, , , и

Мин Сунг Ким

Кафедра биологии рыболовства, Национальный университет Пукён, департамент Пусан, 608-7372

Кореи Морские биоматериалы и аквакультура, Национальный университет Пукён, Пусан, 608-737 Корея

Сын Тхэ Ли

Кафедра биотехнологии животных, Кангвонский национальный университет, Чхунчхон, 200-701 Корея

Чон Мук Лим

Специальность Биомодуляция и кафедра сельскохозяйственной биотехнологии, Сеульский национальный университет, Сеул, 151-921 Корея

Сеунг Пё Гонг

Кафедра биологии рыболовства, Национальный университет Пукён, Пусан, 608-737 Корея

Кафедра морских биоматериалов и Аквакультура, Национальный университет Пукён, Пусан, 608-737 Корея

Лаборатория клеточной биотехнологии, Департамент морских биоматериалов и аквакультуры, Колледж рыбоводства, Национальный университет Пукён, Пусан, 608-737 Корея

Кафедра биологии рыболовства, Национальный университет Пукён, Пусан, 608-737 Корея

Кафедра морских биоматериалов и аквакультуры, Национальный университет Пукён, Пусан, 608-737 Корея

Кафедра биотехнологии животных, Кангвонский национальный университет, Чхунчхон, 200-701 Корея

Специалист в области биомодуляции и кафедры сельскохозяйственной биотехнологии, Сеул Национальный университет, Сеул, 151-921 Корея

Лаборатория клеточной биотехнологии, Департамент морских биоматериалов и аквакультуры, Колледж рыбоводства, Национальный университет Пукён, Пусан, 608-737 Корея

Автор, отвечающий за переписку.

Поступило 27 января 2014 г .; Принято, 2014 г. 28 мая.

Copyright © Springer Science + Business Media Dordrecht 2014

Abstract

Это исследование было проведено для определения оптимального состава среды для замораживания Oryzias dancena линий эмбриональных клеток. Были приготовлены различные среды для замораживания, состоящие из диметилсульфоксида (DMSO), фетальной бычьей сыворотки (FBS) и трегалозы с различной концентрацией, и линия долгосрочных культивированных эмбриональных клеток была заморожена в каждой среде для замораживания с помощью стандартной программы медленного замораживания в течение 7 дней.Путем измерения жизнеспособности и роста клеток после размораживания, замороженных в каждой замораживающей среде, было определено, что оптимальным составом из трех компонентов является 10% ДМСО, 20% FBS и 0,1 М трегалоза. Клетки после оттаивания, замороженные в оптимальной среде для замораживания, показали сходную морфологию и скорость роста с незамороженными клетками. Затем это условие было применено к двум различным сериям экспериментов; (1) замораживание тех же клеток в течение расширенного периода (57 дней) и (2) замораживание краткосрочных культивированных клеток из других партий в течение 7 дней.Жизнеспособность клеток после размораживания была значительно низкой и сопоставимой в наборе 1 и 2, соответственно, по сравнению с результатом длительного культивирования клеток, замороженных в оптимальной замораживающей среде в течение 7 дней, и аналогичной морфологии и скорости роста с незамороженными аналогами. были обнаружены в клетках после оттаивания из обоих наборов. В заключение, в этом исследовании сначала сообщается об оптимальном составе среды для замораживания эмбриональных клеток O. dancena , который может способствовать сохранению видов рыб, а также совершенствованию клеточной биотехнологии, обеспечивая стабильное хранение клеток.

Ключевые слова: Oryzias dancena , Эмбриональные клетки, Замораживающая среда, Криопротекторы

Введение

Криоконсервация клеток позволяет создать банковскую систему клеток, которая позволяет исследователям управлять множеством различных типов клеток для исследований , сохранение и транспортировка (Dash et al. 2008; Higaki et al. 2013; Mauger et al. 2006). С целью управления и сохранения биоразнообразия рыб была разработана технология криоконсервации эмбрионов, яиц и спермы различных видов рыб (Kopeika et al.2005). Однако существуют ограничения в успешной криоконсервации эмбрионов и яиц рыб из-за их большого размера, большой доли желтка, высокого содержания воды и толстого хориона (Chao and Liao 2001; Kobayashi et al. 2007; Strussmann et al. 1999) . Чтобы преодолеть это ограничение, компетентные в отношении развития клетки, такие как эмбриональные клетки, первичные половые клетки и стволовые клетки, были предложены в качестве отличной альтернативы диплоидным эмбрионам для криоконсервации (Kobayashi et al. 2007; Strussmann et al.1999). Кроме того, высокий потенциал развития клеток может способствовать совершенствованию клеточной биотехнологии, такой как трансгенные исследования (Bail et al. 2010; Yan et al. 2013). Для успешного достижения этих целей следует предпочтительно осуществлять оптимизацию видоспецифичных условий замораживания для компетентных в отношении развития клеток рыб, чтобы обеспечить стабильное хранение и поставку клеток. На сегодняшний день во многих исследованиях предпринимались попытки оптимизировать условия замораживания компетентных в отношении развития клеток различных видов рыб, включая бластомеры рыбок данио Danio rerio и примордиальные зародышевые клетки (Higaki et al.2013; Копейка и др. 2005), medaka Oryzias latipes бластомеров (Strussmann et al. 1999), радужной форели Oncorhynchus mykiss первичных зародышевых клеток (Kobayashi et al. 2007; Okutsu et al. 2006), белил Sillago japonica blastomeres (Strussmann et al. . 1999), бластомеры pejerrey Odontesthes bonariensis (Strussmann et al. 1999) и эмбриональные стволовые клетки rohu Labeo rohita (Dash et al. 2008). Marin medaka, Oryzias dancena , является хорошей экспериментальной модельной рыбой, такой как D.rerio и O. latipes , которые являются хорошо известными экспериментальными модельными рыбами из-за нескольких свойств, включая ежедневный нерест, быстрый рост, приводящий к короткому времени генерации, и простое управление в лабораторных масштабах (Lee et al. 2013a). В дополнение к этим преимуществам, переносимость солености пресной и морской воды сделала их хорошей морской модельной рыбой. В нашем предыдущем исследовании сообщалось об установлении линий эмбриональных клеток O. dancena (Lee et al. 2013a), которые проявляют активность, подобную эмбриональным стволовым клеткам (неопубликованные данные), но условия их эффективного замораживания еще не установлены.В этом исследовании, чтобы разработать эффективные условия замораживания эмбриональных клеточных линий O. dancena , мы исследовали оптимальный состав замораживающей среды при стандартной программе медленного замораживания с использованием двух эмбриональных клеточных линий O. dancena ; уже установленный в предыдущем исследовании (долгосрочное культивирование) и новый в этом исследовании (краткосрочное культивирование). Различные среды для замораживания с добавлением различных концентраций диметилсульфоксида (ДМСО), фетальной бычьей сыворотки (FBS) и трегалозы использовались для разработки оптимальных условий замораживания линий эмбриональных клеток, а жизнеспособность и скорость роста замороженных-размороженных клеток были измерены для проверки эффективности. условия замораживания.

Материалы и методы

Культура клеток

В этом исследовании были использованы две линии эмбриональных клеток O. dancena . Одна представляла собой клеточную линию в 200-й субкультуре, которая уже была создана и описана в нашем предыдущем отчете (долгосрочное культивирование; Lee et al. 2013a), а другая была приготовлена ​​в этом исследовании, как описано ранее, и культивировалась в 49-й субкультуре (короткое -рокультивированный). Культуральная среда представляла собой среду Игла, модифицированную Дульбекко (DMEM; Gibco, Grand Island, NY, USA), с добавлением 4.5 г / л d-глюкозы, 20 мМ HEPES, 1% (об. / Об.) Заменимых аминокислот (Gibco), 15% (об. / Об.) FBS (Cellgro, Манассас, Вирджиния, США), 1% (об. / v) рыбная сыворотка, 50 мкг / мл экстракта эмбриона, 1% (об. / об.) смесь пенициллин-стрептомицин (Gibco), 10 нг / мл рекомбинантного человеческого основного фактора роста фибробластов (bFGF; Gibco), 100 мкМ β-меркаптоэтанол ( Gibco), 2 нМ селенита натрия (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) и 1 мМ пирувата натрия (Gibco). Рыбная сыворотка и экстракт эмбриона были приготовлены, как описано ранее (Lee et al. 2013a).Клетки культивировали на планшете для культивирования тканей, покрытом 0,1% желатином (Sigma-Aldrich), с культуральной средой в инкубаторе 28 ° C с воздушной атмосферой и субкультивировали каждые 2 или 3 дня, когда они достигли 80-90% слияния.

Замораживание и оттаивание эмбриональных клеток

Для замораживания эмбриональных клеток культивируемые клетки дважды промывали фосфатно-солевым буфером Дульбекко (DPBS; Gibco), трипсинизировали 0,05% трипсин-ЭДТА (Gibco) и собирали центрифугированием ( 400 г, 4 мин).Осадки клеток суспендировали в замораживающей среде, состоящей в основном из DMEM (Gibco) с добавлением различных концентраций ДМСО (0, 10, 20 и 40%; Sigma-Aldrich), FBS (0, 20, 40 и 60%; Cellgro) и / или трегалоза (0, 0,1, 0,2 и 0,4 М; Вако, Осака, Япония). Из клеточной суспензии 1 × 10 6 клеток переносили в криогенные флаконы объемом 1,2 мл (Sigma-Aldrich), которые затем переносили в морозильный контейнер (Thermo Scientific, Вернон-Хиллз, Иллинойс, США) со скоростью охлаждения — 1 ° C / мин.Через 12 часов в морозильной камере при -75 ° C криогенные флаконы хранили в жидком азоте (-196 ° C) в течение 7 или 57 дней. Для размораживания замороженных эмбриональных клеток криогенные флаконы помещали в водяную баню при 37 ° C на 2 мин. После исчезновения кристаллов льда суспензию клеток переносили в пробирки на 15 мл (SPL Life Sciences, Pocheon, Корея) с 3 мл культуральной среды, и размороженные клетки собирали центрифугированием при 400 g в течение 4 мин.

Жизнеспособность и ростовая активность замороженных-размороженных клеток

Для оценки жизнеспособности клеток 1 × 10 5 клеток после размораживания были засеяны сразу после размораживания в лунку 96-луночного микропланшета (Thermo Scientific) с культуральной средой и Их жизнеспособность оценивали с помощью набора для подсчета клеток-8 (Dojindo, Kushu, Japan) в соответствии с инструкциями производителя.Незамороженные клетки использовали в качестве контроля. Жизнеспособность рассчитывали как оптическую плотность образца / оптическую плотность контроля × 100. Для измерения активности роста замороженных-оттаявших клеток 1 × 10 5 клеток после оттаивания высевали в лунку с 0,1% желатиновым покрытием 24- лунку культурального планшета (SPL) заполняли питательной средой и культивировали в течение 48 ч в инкубаторе при 28 ° C с воздушной атмосферой. После этого культивированные клетки собирали с использованием 0,05% трипсина-ЭДТА (Gibco) и подсчитывали количество клеток с помощью гемоцитометра (Marienfeld, Lauda-Königshofen, Германия).Эти эксперименты были повторены трижды независимо.

Измерение скорости роста

Для измерения скорости роста сначала 1 × 10 6 клеток после размораживания стабилизировали путем культивирования в обычных условиях культивирования клеток в течение 48 часов. Затем 2 × 10 4 клеток после оттаивания или незамороженных клеток на лунку засевали в покрытые 0,1% желатином 48-луночные чашки MultiDish (Thermo Scientific), заполненные культуральной средой, и культивировали в течение 9 дней в инкубаторе при 28 ° C с воздушная атмосфера.Среду для культивирования меняли каждые 3 дня после первой смены в 1 день культивирования. С 1 по 9 день культивирования пролиферирующие клетки подсчитывали ежедневно с помощью гемоцитометра (Marienfeld). Этот эксперимент был повторен трижды независимо.

Статистический анализ

Для анализа числовых данных использовалось программное обеспечение системы статистического анализа (SAS). Когда дисперсионный анализ (ANOVA) выявил значительный первичный эффект, методы лечения впоследствии сравнивали по методу наименьших квадратов или по методу Дункана. P <0,05 считались показателем значимых различий.

Результаты

Оптимизация среды для замораживания

O. dancena эмбриональных клеток

Для определения оптимальных условий замораживания O. dancena эмбриональных клеточных линий, различные концентрации ДМСО, FBS и трегалозы были использованы для приготовления замораживающей среды. который в основном состоит из DMEM, содержащего криопротекторы (ДМСО или трегалозу) и FBS. Сначала 0, 10, 20 и 40% ДМСО добавляли к замораживающей среде, содержащей 40% FBS, и длительно культивируемые эмбриональные клетки замораживали в каждой замораживающей среде.Через 7 дней жизнеспособность замороженных-размороженных клеток в каждой замораживающей среде показала значительные различия (рис. А, p <0,0001), при этом самая высокая жизнеспособность (64,3 ± 12,6%) была обнаружена в клетках, замороженных 10% ДМСО. . В следующей серии экспериментов в среду для замораживания, содержащую 10% ДМСО, добавляли 0, 20, 40 и 60% FBS, и эмбриональные клетки, культивируемые в течение длительного периода времени, замораживали в каждой среде для замораживания в течение 7 дней. Не было обнаружено значительных различий в жизнеспособности клеток среди групп замороженных-размороженных клеток (рис. B; 42.От 3 ± 7,7 до 60,1 ± 8,7% жизнеспособности, p = 0,0796). Наконец, к замораживающей среде добавляли 0, 0,1, 0,2 и 0,4 М трегалозы, которая имела фиксированные концентрации 10% ДМСО и 20% FBS, и оценивали тот же параметр. Клетки, замороженные 0,1 М трегалозой, показали самую высокую жизнеспособность по сравнению с другими группами (от 73,5 ± 10,2% против 31,9 ± 12,3 до 57,9 ± 11,9%, p <0,0001), но довольно высокую концентрацию (0,4 М) трегалозы. значительно подавлял жизнеспособность клеток после размораживания.

Определение оптимального состава среды для замораживания Oryzias dancena длительно культивируемые эмбриональные клетки. Клетки замораживали в среде для замораживания, содержащей различные концентрации диметилсульфоксида (ДМСО), фетальной бычьей сыворотки (FBS) или трегалозы, в течение 7 дней, и жизнеспособность клеток после оттаивания измеряли с помощью набора для подсчета клеток-8. Незамороженные клетки использовали в качестве контроля, и жизнеспособность рассчитывали как оптическую плотность образца / оптическую плотность контроля × 100.Значения указывают среднее ± стандартное отклонение. A Жизнеспособность клеток в зависимости от различных концентраций ДМСО в замораживающей среде, содержащей 40% FBS. Был обнаружен значительный эффект модели ( p <0,0001), и самая высокая выживаемость была выявлена ​​в клетках, замороженных 10% ДМСО. B Жизнеспособность клеток в зависимости от различных концентраций FBS в замораживающей среде, содержащей 10% ДМСО. Между группами лечения не было обнаружено значительных различий ( p = 0,0796). C Жизнеспособность клеток в зависимости от различных концентраций трегалозы в замораживающей среде, содержащей 10% ДМСО и 20% FBS.Был обнаружен значительный модельный эффект ( p <0,0001), и самая высокая выживаемость была обнаружена в клетках, замороженных 0,1 М трегалозой. A C Различные буквы на графике указывают на существенные различия

Рост эмбриональных клеток после оттаивания

Для подтверждения результатов жизнеспособности клеток после замораживания-оттаивания и определения того, сохраняют ли клетки после оттаивания потенциал роста, клетки Количество замороженных-размороженных клеток из всех групп обработки, которые использовали ДМСО, FBS и трегалозу, подсчитывали после культивирования в течение 2 дней в обычных условиях культивирования (рис.). Как и ожидалось, группы с 0 и 40% DMSO с 40% FBS, которые имели очень низкую жизнеспособность клеток после оттаивания, не росли вообще, а группа 0,1 M трегалозы с 10% DMSO и 20% FBS, которые имели наивысшую жизнеспособность клеток после оттаивания, показали значительно большее количество клеток, чем другие (30,7 ± 3,1 × 10 4 по сравнению с 0 до 26,5 ± 2,29 × 10 4 клеток, p <0,0001). Хотя среди групп было обнаружено различное количество клеток, было установлено, что все замороженные-размороженные клетки, за исключением двух групп, сохраняли потенциал роста.

Рост после оттаивания Oryzias dancena длительно культивируемых эмбриональных клеток. 1 × 10 5 клеток после оттаивания из всех групп обработки, которые использовали диметилсульфоксид (ДМСО), фетальную бычью сыворотку (FBS) или трегалозу, культивировали в течение 2 дней и подсчитывали количество клеток в каждой. Значения указывают среднее ± стандартное отклонение. Все клетки после оттаивания, за исключением двух групп (группы 0 и 40% ДМСО при 40% FBS), были способны расти в культуре, и самый высокий уровень извлечения клеток был достигнут в клетках после оттаивания, которые были заморожены в замораживающей среде, содержащей 10% ДМСО, 20% FBS и 0.1 M трегалозы. Эффект модели был <0,0001 и a h разные буквы указывают на существенные различия

Клетки после оттаивания, которые были заморожены в замораживающей среде, содержащей 10% ДМСО, 20% FBS и 0,1 M трегалозы, были дополнительно культивированы и сравнены с незамороженные клетки на морфологию клеток и скорость роста. Как показано на фиг. А, сходная морфология клеток была идентифицирована до и после замораживания-оттаивания. Время удвоения эмбриональных клеток после размораживания и незамороженных эмбриональных клеток составило 26.64 и 26,24 ч соответственно, не показывая разницы между двумя популяциями клеток (рис. B).

Сравнение морфологии клеток и активности роста незамороженных клеток и клеток после размораживания. Долгосрочные культивированные эмбриональные клетки замораживали в замораживающей среде, содержащей 10% диметилсульфоксида, 20% фетальной бычьей сыворотки и 0,1 М трегалозы, в течение 7 дней, и их морфология ( A ) и скорость роста ( B ) после оттаивания были по сравнению с незамороженными клетками. Две группы клеток не показали никаких различий ни в морфологии, ни в скорости роста. Шкала = 50 мкм

Подтверждение оптимальных условий замораживания

Для подтверждения оптимальных условий замораживания с использованием 10% ДМСО, 20% FBS и 0,1 М трехаолозы были разработаны два различных экспериментальных набора; (1) эмбриональные клетки, культивируемые в течение длительного периода времени, замораживали в течение периода увеличения продолжительностью 57 дней и (2) эмбриональные клетки, культивируемые в течение короткого периода времени из другой партии, замораживали в течение 7 дней в тех же условиях замораживания. В результате, 50,7 ± 6,8 и 57,7 ± 8,3% жизнеспособности клеток после размораживания были идентифицированы в наборе 1 и наборе 2 соответственно (рис.а). По сравнению с предыдущим результатом замораживания клеток длительного культивирования в течение 7 дней, клетки, замороженные в течение периода размножения, показали значительно более низкую жизнеспособность (73,5 ± 10,2 против 50,7 ± 6,8%, p <0,05), в то время как клетки, культивируемые кратковременно. из другой партии не показали значительной разницы в жизнеспособности клеток после размораживания (73,5 ± 10,2 против 57,7 ± 8,3%, p > 0,05). Морфология клеток после оттаивания была аналогична морфологии незамороженных клеток в обеих популяциях клеток после оттаивания из двух экспериментальных наборов (рис.б), и аналогично, скорости роста существенно не различались до и после замораживания-оттаивания в обеих популяциях клеток (рис. c, d).

Проверка оптимальных условий замораживания с использованием 10% диметилсульфоксида, 20% фетальной бычьей сыворотки и 0,1 М трегалозы. Были разработаны два разных набора экспериментов; (1) замораживание длительно культивируемых клеток в течение расширенного периода (57 дней) и (2) замораживание краткосрочных культивируемых клеток из другой партии в течение 7 дней. A Сравнение жизнеспособности клеток после размораживания с жизнеспособностью клеток, подвергнутых длительному культивированию, замороженных в течение 7 дней.Жизнеспособность клеток после оттаивания была значительно ниже и сопоставима в наборах 1 и 2, соответственно. B D Морфология и скорость роста клеток после размораживания. Сходные морфологии были выявлены до (B1 для набора 1 и B3 для набора 2) и после (B2 для набора 1 и B4 для набора 2) замораживания-оттаивания из обоих наборов. Шкала = 50 мкм. Аналогичным образом, клетки после оттаивания из обоих экспериментальных наборов показали сравнимую скорость роста с незамороженными аналогами (C для набора 1 и D для набора 2). термин культивируемая линия эмбриональных клеток от O.dancena , что впоследствии было подтверждено на тех же клетках, замороженных в течение периода размножения, и в другой партии эмбриональных клеток, культивируемых на короткое время. Оптимальный состав замораживающей среды представлял собой DMEM с добавлением 10% ДМСО, 20% FBS и 0,1 М трегалозы. В программе медленного замораживания клеток определение состава замораживающей среды является наиболее важной задачей, потому что замораживающая среда играет ключевую роль в предотвращении повреждения клеток во время процесса замораживания (Hunt 2011).Профилактика криоповреждений фактически достигается с помощью криопротектора, добавленного к замораживающей среде, путем подавления образования кристаллов льда во время процесса замораживания (Fuku et al. 1992), и, таким образом, следует тщательно определять выбор криопротектора и его концентрацию. Кроме того, его состав следует по-разному применять к разным видам, учитывая их различные физиологические свойства. Наиболее распространенным из них является ДМСО, который повсеместно используется для криоконсервации клеток животных, таких как эмбриональные стволовые клетки человека (10%; Lee and Lee, 2011), сперматогонические стволовые клетки мыши (10%; Lee et al.2013b), примордиальные половые клетки птицы (10%, Setioko et al.2007) и эмбриональные стволовые клетки рыб (0,8 M; Dash et al. 2008). Аналогичный результат был получен из этого исследования. Оптимальная концентрация ДМСО в замораживающей среде для линий эмбриональных клеток O. dancena составляла 10%, при этом достаточное количество клеток для дальнейшего использования можно было извлечь из небольшого количества клеток после размораживания через 2 дня культивирования, что позволяет предположить, что Программа медленного замораживания с использованием ДМСО может быть хорошо применена к O.Dancena линии эмбриональных клеток для эффективной криоконсервации. FBS является основным компонентом замораживающей среды, поскольку он играет ключевую роль в снижении окислительного стресса (Freimark et al. 2011; Gutteridge and Quinlan 1993). В этом исследовании добавление FBS к среде для замораживания с содержанием 10% ДМСО не влияло на жизнеспособность клеток после оттаивания. Тем не менее, мы решили использовать минимальную концентрацию FBS (20%) в следующей серии экспериментов, основываясь на предыдущих сообщениях о полезности FBS при замораживании клеток (Marco-Jiménez et al.2006 г.). Эффективность FBS в замораживающей среде была впоследствии продемонстрирована в эксперименте, в котором измеряли рост эмбриональных клеток O. dancena после оттаивания. Отсутствие FBS в среде 10% ДМСО привело к значительному снижению количества клеток, чем другие группы, содержащие FBS, в среде 10% ДМСО после того, как клетки из каждой группы после оттаивания культивировали в течение 2 дней. Эти результаты предполагают, что добавление FBS в среду для замораживания, несомненно, необходимо для стабильного замораживания линий эмбриональных клеток из O.dancena вида. Сообщалось, что ДМСО обладает цитотоксическим действием, вызывая изменение текучести мембран и цитоскелета (Brayton 1986; Hunt 2011; Katsuda et al. 1987; Miranda et al. 1978). Чтобы еще больше повысить жизнеспособность клеток после оттаивания, мы сосредоточились на трегалозе, дисахариде, состоящем из двух единиц альфа-глюкозы, который является отличным стабилизатором мембран и белков при стрессе дегидратации (Morgan et al. 2006; Rudolph and Crowe 1985) . Как и ожидалось, добавление трегалозы значительно повысило жизнеспособность клеток после размораживания до 73.5 ± 10,2%. Этот улучшающий эффект трегалозы также подтверждается несколькими отчетами о криоконсервации клеток (Aboagla and Terada 2003; Eroglu et al. 2001). Кроме того, сообщалось, что есть много других компонентов, которые могут улучшить эффективность замораживания клеток. Обработка компонентов, обладающих антиоксидантной активностью в процессе замораживания, может удалить активные формы кислорода с последующей стабилизацией клеток после размораживания (Uchendu et al. 2010). К таким компонентам относятся витамины C и E (Uchendu et al.2010; Cabrita et al. 2011), таурин (Martínez-Páramo et al. 2013), цистеин (Tuncer et al. 2010) и так далее. Кроме того, известно, что белки-антифризы, которые могут эффективно ингибировать перекристаллизацию льда, могут улучшить выживаемость эритроцитов во время криоконсервации (Carpenter and Hansen 1992; Chao et al. 1996). Дальнейшие эксперименты с этими компонентами будут полезны для повышения жизнеспособности после оттаивания линий эмбриональных клеток от O. dancena .

Успешное замораживание ранних субкультивированных эмбриональных клеток может быть достигнуто с помощью замораживающей среды, оптимизированной в этом исследовании.Эмбриональные клетки в ранней субкультуре обладают клеточными свойствами, более близкими к свойствам исходных клеток, из которых были получены эмбриональные клетки, с точки зрения эпигенетического состояния и хромосомной нормальности (Bork et al. 2010; Kanatsu-Shinohara et al. 2005). Таким образом, криоконсервация таких клеток позволяет непрерывно использовать относительно нетрансформированные клетки для биотехнологических приложений. Более того, данные свидетельствуют о том, что оптимальный состав замораживающей среды можно универсально использовать в разных партиях клеток.Наши результаты для клеток, замороженных в течение периода размножения, показали, что оптимизированный состав разработанной замораживающей среды может быть эффективным даже при длительном криоконсервации, показывая выживаемость клеток более чем наполовину (50,7 ± 6,8%) в замороженных клетках. Однако после замораживания в течение 57 дней жизнеспособность клеток была значительно ниже, чем после 7 дней. Теоретически клетки могут быть криоконсервированы в течение длительных периодов времени без каких-либо клеточных изменений при -196 ° C, потому что фазовые изменения воды не происходят при этой температуре, и, таким образом, единственным источником повреждения является прямая ионизация фоновым излучением (Mazur 1988).Наши данные свидетельствуют о том, что может быть связано с нестабильностью клеток, вызванной неоптимальными условиями культивирования эмбриональных клеток O. dancena . В таких обстоятельствах клетки могут чутко реагировать на свое микроокружение. Несмотря на использование одного и того же протокола и тщательного управления клетками во всех независимых экспериментах, незначительные различия в начальных условиях до замораживания могут спровоцировать сильные отклонения в конечной точке. Субоптимальные условия культивирования эмбриональных клеток O. dancena могут косвенно подтверждаться относительно низкой жизнеспособностью клеток после оттаивания (73.Максимум 5 ± 10,2%) по сравнению с таковыми у высших позвоночных, в значительной степени достигающих более 80% (Ock and Rho 2011; Naaldijk et al. 2012; Lee et al. 2013c). Различные серии экспериментов, посвященные продолжительности замораживания и использующие краткосрочные культивируемые клетки или другую серию клеточных линий O. dancena , предоставят более четкие доказательства. Тем не менее жизнеспособные клетки после размораживания после замораживания в течение периода размножения все еще сохраняли нормальную скорость роста, и их количество было достаточным для амплификации в культуре для дальнейшего использования.

В заключение мы сначала демонстрируем, что эмбриональные клетки O. dancena можно стабильно замораживать для криоконсервации в оптимальной замораживающей среде, состоящей из 10% ДМСО, 20% FBS и 0,1 М трегалозы. Результаты этого исследования не только могут предоставить полезную информацию для сохранения видов рыб, но также будут способствовать развитию клеточной биотехнологии, использующей преимущества этого вида клеток за счет эффективного хранения и доставки клеток.

Благодарности

Это исследование было поддержано Программой фундаментальных научных исследований через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемого Министерством образования, науки и технологий (NRF-2012R1A1A1011572).

Список литературы

  • Абоагла Е.М., Терада Т. Текучесть мембраны целевой сперматозоиды с повышенным содержанием трегалозы и ее защита во время замораживания. Биол Репрод. 2003; 69: 1245–1250. DOI: 10.1095 / биолрепрод.103.017889. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Бейл П.Й., Депинс А., Шене Н., Маэ С., Мейсс Г., Лаббе С. Оптимизация инъекции соматических клеток с точки зрения переноса ядер у золотой рыбки. BMC Dev Biol. 2010; 8: 64. DOI: 10.1186 / 1471-213X-10-64. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Bork S, Pfister S, Witt H, Horn P, Korn B, Ho AD, Wagner W.Характер метилирования ДНК изменяется при длительном культивировании и старении мезенхимальных стромальных клеток человека. Ячейка старения. 2010; 9: 54–63. DOI: 10.1111 / j.1474-9726.2009.00535.x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Brayton CF. Диметилсульфоксид (ДМСО): обзор. Cornell Vet. 1986; 76: 61–90. [PubMed] [Google Scholar]
  • Cabrita E, Ma S, Diogo P, Martínez-Páramo S, Sarasquete C, Dinis MT. Влияние некоторых аминокислот и витаминов на подвижность, жизнеспособность и фрагментацию ДНК сперматозоидов рыб после размораживания.Anim Reprod Sci. 2011; 125: 189–195. DOI: 10.1016 / j.anireprosci.2011.03.003. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Карпентер Дж. Ф., Хансен TN. Белок-антифриз модулирует выживаемость клеток во время криоконсервации: посредничество через влияние на рост кристаллов льда. Proc Natl Acad Sci U S. A. 1992; 89: 8953–8957. DOI: 10.1073 / pnas.89.19.8953. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Chao NH, Liao IC. Криоконсервация гамет и эмбрионов рыб и моллюсков. Аквакультура.2001; 197: 161–189. DOI: 10.1016 / S0044-8486 (01) 00586-5. [CrossRef] [Google Scholar]
  • Чао Х., Дэвис П.Л., Карпентер Дж. Ф. Влияние белков-антифризов на выживаемость эритроцитов во время криоконсервации. J Exp Biol. 1996; 199: 2071–2076. [PubMed] [Google Scholar]
  • Dash SN, Routray P, Dash C, Guru BC, Swain P, Sarangi N. Использование нетоксичного криопротектора трегалозы улучшает восстановление и функцию эмбриональных стволовых клеток рыб после криогенного хранения. Curr Stem Cell Res Ther. 2008. 3: 277–287.DOI: 10,2174 / 157488808786733999. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Eroglu A, Toth TL, Toner M. Криозащита ооцитов мыши и человека с помощью внутриклеточной трегалозы. Криобиология. 2001; 43: 320. [Google Scholar]
  • Freimark D, Sehl C, Weber C, Hudel K, Czermak P, Hofmann N, Spindler R, Glasmacher B. Систематическая оптимизация параметров протокола Me 2 SO- и бессывороточной криоконсервации мезенхимы человека стволовые клетки. Криобиология. 2011; 63: 67–75. DOI: 10.1016 / j.криобиол.2011.05.002. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Фуку Э, Кодзима Т., Шиоя Ю., Маркус Дж. Дж., Дауни Б.Р. Экстракорпоральное оплодотворение и развитие замороженных-размороженных ооцитов крупного рогатого скота. Криобиология. 1992; 29: 485–492. DOI: 10.1016 / 0011-2240 (92)

    -3. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Gutteridge JM, Quinlan GJ. Антиоксидантная защита нормальной человеческой плазмы от органических и неорганических кислородных радикалов: важная первичная роль железосвязывающих и окисляющих железо белков. Biochim Biophys Acta.1993; 1156: 144–150. DOI: 10.1016 / 0304-4165 (93)

    -V. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Higaki S, Kawakami Y, Eto Y, Yamaha E, Nagano M, Katagiri S, Takada T, Takahashi Y. Криоконсервация первичных зародышевых клеток рыбок данио (Danio rerio) путем витрификации желтка -интактные эмбрионы и эмбрионы с истощенным желтком с использованием различных растворов криопротекторов. Криобиология. 2013. 67: 374–382. DOI: 10.1016 / j.cryobiol.2013.10.006. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Hunt CJ. Криоконсервация стволовых клеток человека для клинического применения: обзор.Transfus Med Hemother. 2011; 38: 107–123. DOI: 10,1159 / 000326623. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Kanatsu-Shinohara M, Ogonuki N, Iwano T, Lee J, Kazuki Y, Inoue K, Miki H, Takehashi M, Toyokuni S, Shinkai Y, Oshimura М., Ишино Ф., Огура А., Шинохара Т. Генетические и эпигенетические свойства стволовых клеток мужской зародышевой линии мыши во время длительного культивирования. Разработка. 2005. 132: 4155–4163. DOI: 10.1242 / dev.02004. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Кацуда С., Окада Ю., Наканиси И.Диметилсульфоксид индуцирует образование микротрубочек в культивируемых артериальных гладкомышечных клетках. Cell Biol Int Rep., 1987; 11: 103–110. DOI: 10.1016 / 0309-1651 (87) -X. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Кобаяши Т., Такеучи Ю., Такеучи Т., Йошизаки Г. Получение жизнеспособных рыб из криоконсервированных примордиальных зародышевых клеток. Mol Reprod Dev. 2007; 74: 207–213. DOI: 10.1002 / мрд.20577. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Копейка Дж., Чжан Т., Роусон Д.М., Элгар Г. Влияние криоконсервации на митохондриальную ДНК бластомерных клеток рыбок данио (Danio rerio).Mutat Res. 2005; 570: 49–61. DOI: 10.1016 / j.mrfmmm.2004.09.007. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Lee JE, Lee DR. Эмбриональные стволовые клетки человека: получение, поддержание и криоконсервация. Стволовые клетки Int J. 2011; 4: 9–17. DOI: 10.15283 / ijsc.2011.4.1.9. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Lee D, Kim MS, Nam YK, Kim DS, Gong SP. Создание и характеристика постоянных клеточных линий из эмбрионов Oryzias dancena . Fish Aquat Sci. 2013; 16: 177–185.[Google Scholar]
  • Ли Я., Ким Й., Ким Б. Дж., Юнг М. С., Ау Дж. Х., Сео Дж. Т., Пак И. С., Ли Ш., Рю Б. Криоконсервация сперматогониальных стволовых клеток мышей в диметилсульфоксиде и полиэтиленгликоле. Биол Репрод. 2013; 89: 109. DOI: 10.1095 / биолрепрод.113.111195. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Ли Ю.А., Ким Й.Х., Ким Б.Дж., Ким Б.Г., Ким К.Дж., Ау Дж.Х., Шмидт Дж.А., Рю BY. Криоконсервация в трегалозе сохраняет функциональную способность сперматогониальных стволовых клеток мыши. PLoS ONE. 2013; 8: e54889.DOI: 10.1371 / journal.pone.0054889. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Марко-Хименес Ф., Гарсон Д.Л., Пеньяранда Д.С., Перес Л., Виудес-де-Кастро МП, Висенте Дж. С., Жовер М., Астуриано Дж. Ф. Криоконсервация сперматозоидов европейского угря ( Anguilla anguilla ): влияние коэффициента разбавления, добавок фетальной бычьей сыворотки и криопротекторов. Криобиология. 2006; 53: 51–57. DOI: 10.1016 / j.cryobiol.2006.03.011. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Мартинес-Парамо С., Диого П., Динис М. Т., Соарес Ф, Сараскете С., Кабрита Э.Влияние двух серосодержащих аминокислот, таурина и гипотаурина на криоконсервацию спермы европейского морского окуня ( Dicentrarchus labrax ). Криобиология. 2013; 66: 333–338. DOI: 10.1016 / j.cryobiol.2013.04.001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Mauger PE, Le Bail PY, Labbé C. Криобанк соматических клеток рыб: оптимизация культуры эксплантов плавников и криоконсервация плавниковых клеток. Comp Biochem Physiol B: Biochem Mol Biol. 2006; 144: 29–37. DOI: 10.1016 / j.cbpb.2006.01.004. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Mazur P.Остановка биологического времени. Замораживание живых клеток. Ann N Y Acad Sci. 1988; 541: 514–531. DOI: 10.1111 / j.1749-6632.1988.tb22288.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Миранда А.Ф., Нетте Г., Хан С., Брокбанк К.Г.М., Шонберг М. Изменение фенотипа миобластов диметилсульфоксидом. Proc Natl Acad Sci USA. 1978; 75: 3826–3830. DOI: 10.1073 / pnas.75.8.3826. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Morgan CA, Herman N, White PA, Vesey G. Сохранение микроорганизмов путем сушки: обзор.J Microbiol Methods. 2006; 66: 183–193. DOI: 10.1016 / j.mimet.2006.02.017. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Naaldijk Y, Staude M, Fedorova V, Stolzing A. Влияние различных скоростей замораживания во время криоконсервации мезенхимальных стволовых клеток крысы с использованием комбинаций гидроксиэтилкрахмала и диметилсульфоксида. BMC Biotechnol. 2012; 12: 49. DOI: 10.1186 / 1472-6750-12-49. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Ock SA, Rho GJ. Влияние диметилсульфоксида (ДМСО) на криоконсервацию трансплантата клеток мезенхимальных стволовых клеток свиней (pMSCs).2011; 20: 1231–1239. DOI: 10.3727 / 096368910X552835. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Окуцу Т., Яно А., Нагасава К., Шикина С., Кобаяси Т., Такеучи Ю., Йошизаки Г. Манипуляции с зародышевыми клетками рыб: визуализация, криоконсервация и трансплантация. J Reprod Dev. 2006. 52: 685–693. DOI: 10.1262 / jrd.18096. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Рудольф А.С., Кроу Дж. Х. Стабилизация мембран при замораживании: роль двух природных криопротекторов, трегалозы и пролина. Криобиология.1985. 22: 367–377. DOI: 10.1016 / 0011-2240 (85) -1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Сетиоко А.Р., Тагами Т., Тасе Х, Накамура И., Такеда К., Нирасава К. Криоконсервация первичных половых клеток (ППК) из эмбрионов белого леггорна с использованием коммерческих криопротекторов. J. Poult Sci. 2007; 44: 73–77. DOI: 10.2141 / JPSA.44.73. [CrossRef] [Google Scholar]
  • Strussmann CA, Nakatsugawa H, Takashima F, Hasobe M, Suzuki T., Takai R. Криоконсервация изолированных бластомеров рыб: влияние стадии клеток, концентрации криопротектора и скорости охлаждения на выживаемость после оттаивания.Криобиология. 1999; 39: 252–261. DOI: 10.1006 / cryo.1999.2208. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Tuncer PB, Bucak MN, Büyükleblebici S, Sarıözkan S, Yeni D, Eken A, Akalın PP, Kinet H, Avdatek F, Fidan AF, Gündoğan M. Эффект цистеина и глутатиона на сперму и параметры окислительного стресса после разморозки спермы быков. Криобиология. 2010. 61: 303–307. DOI: 10.1016 / j.cryobiol.2010.09.009. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Ученду Е.Е., Леонард С.В., Трабер М.Г., Рид Б.М. Витамины C и E улучшают отрастание и уменьшают перекисное окисление липидов кончиков побегов ежевики после криоконсервации.Отчет о растительных клетках 2010; 29: 25–35. DOI: 10.1007 / s00299-009-0795-у. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Yan Y, Hong N, Chen T, Li M, Wang T, Guan G, Qiao Y, Chen S, Schartl M, Li CM, Hong Y. Нацеливание на ген p53 с помощью гомологичных рекомбинация в ЭС клетках рыб. PLoS ONE. 2013; 8: e59400. DOI: 10.1371 / journal.pone.0059400. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]

Успешное жидкое хранение стволовых клеток периферической крови при отрицательной температуре ниже нуля

Все более широкое использование трансплантации стволовых клеток в ответ на клинические потребности сделало это необходимым исследовать новые методы хранения стволовых клеток.

Упрощенный метод криоконсервации при -80 ° C с использованием комбинации криопротектора ДМСО, внутриклеточного криопротектора, и ГЭК, внеклеточного криопротектора, до сих пор успешно использовался для замораживания PBSC для трансплантации. Сообщалось, что средняя скорость восстановления КОЕ-ГМ после 18 месяцев упрощенной криоконсервации составила 73,8 ± 4,1%. 11 Глубокая заморозка может быть единственным методом длительного (от месяцев до лет) сохранения PBSC. Однако в клинических условиях краткосрочных (примерно 72 часа) методов консервирования стволовых клеток может быть достаточно, поскольку химиотерапия с высокими дозами может быть скорректирована и завершена в течение 72 часов.Кроме того, при тандемной трансплантации необходим повторный сбор стволовых клеток; поэтому давно ждали разработки простых методов и менее дорогостоящего оборудования для хранения PBSC.

Некоторые исследователи сообщили о некоторых испытаниях по сохранению гемопоэтических стволовых клеток незамерзанием. Pettengell et al 4,7 исследовали сохранение без замораживания гемопоэтических стволовых клеток из костного мозга, продуктов лейкафереза ​​и цельной крови. Они обнаружили, что выживаемость CFU-GM через 48 часов составила 68%, а через 72 часа — 47% в аутологичной сыворотке и цитратфосфатдекстрозе при 4 ° C.Наши результаты хранения при 4 ° C согласуются с результатами Pettengell.

Поскольку уровень ферментативной активности зависит от температуры (согласно правилу Вант-Гоффа), эффективность гипотермического консервирования связана с тем, как оно замедляет метаболические нарушения и снижает потребление клеточной энергии сохраненными клетками. Однако при гипотермической консервации активность Na + -K + АТФазы, которая участвует в активном мембранном транспорте Na + -K + , подавляется, и Na + во внеклеточном растворе попадает в клетки. зависит от градиента концентрации.В результате клетки набухают, потому что Na + накапливает воду (набухание клеток, вызванное гипотермией). Чтобы свести к минимуму набухание клеток, среда для хранения должна иметь состав, близкий к составу внутриклеточного электролитного состава, и иметь компонент, для которого клеточная мембрана непроницаема, чтобы противодействовать коллоидному онкотическому давлению, создаваемому внутриклеточными белками или непроницаемыми анионами. Такие вещества в растворе для хранения в холодильнике называются непроницаемыми. Далее, для предотвращения внутриклеточного ацидоза, вызванного анаэробным гликолизом, носители не должны содержать глюкозу.И третье важное соображение касается энергетического обмена. Внутриклеточный аденозинтрифосфат (АТФ) быстро разлагается при хранении в условиях гипотермии. Однако, когда холодное хранение заканчивается, необходимо быстрое восстановление насосной активности Na + -K + , которая требует АТФ, и поэтому важно обеспечить предшественники АТФ для синтеза АТФ. Исходя из вышеизложенных соображений, мы использовали раствор UW в качестве носителя для хранения при минусовых температурах без замораживания, чтобы избежать различных недостатков, связанных с переохлаждением.

Раствор

UW (разработанный Belzer и др. ) — это раствор для хранения в холодильнике, используемый для сохранения многих пересаживаемых органов, таких как печень, поджелудочная железа и почки, и его успешная консервативная способность теперь подтверждена при клинической трансплантации органов. 13 Раствор UW доводят до pH 7,4 при комнатной температуре путем добавления NaOH, и его осмоляльность составляет 320 ± 10 мОсм / л. Решение содержит ряд компонентов. Калий-лактобионовая кислота является ключевым агентом, который действует как непроницаемое вещество, подавляя вызванное гипотермией набухание клеток.Рафиноза добавляется для дополнительной осмотической поддержки. Другими веществами в растворе UW являются аденозин, который является эффективным субстратом для ресинтеза АТФ, и глутатион как поглотитель бескислородных радикалов. 14 Концентрации электролитов регулируются так, чтобы они напоминали состав внутриклеточного электролита (25 мМ натрия и 120 мМ калий), чтобы уменьшить ионный обмен через клеточную мембрану во время фазы гипотермии. Единственный момент, требующий внимания, — это высокая концентрация калия, которую следует удалить, вымыв перед повторной инфузией пациентам.

О концепции и преимуществах использования раствора UW для незамерзающего хранения при отрицательных температурах сообщили несколько исследователей в области трансплантационной хирургии. Эффекты хранения при отрицательных температурах в растворе UW без замораживания были исследованы для сохранения целых сердец 15 и печени. 16 Результаты показали, что хранение при отрицательных температурах лучше, чем при 4 ° C. В области переохлажденного хранения Matsuda et al. 17 оценили преимущества переохлажденного хранения с использованием изолированных гепатоцитов крысы, суспендированных в растворе UW при -4 ° C.После 48 часов хранения переохлажденная группа показала значительно лучшие результаты в тесте исключения трипанового синего, содержании АТФ, митохондриальной активности и морфологическом исследовании по сравнению с группой, получавшей 4 ° C.

Теперь мы показали, что целостность стволовых клеток оптимально сохранялась, когда PBSC хранились в переохлажденном состоянии при -2 ° C в растворе UW без каких-либо криопротекторов и при самых высоких значениях выживаемости ядерных клеток (91,6%), выживаемости CFU-GM (67,3%) и исключение трипанового синего (92%) были достигнуты через 72 часа.До 72 часов PBSC можно хранить при -2 ° C с потерей только одной трети CFU-GM, что было меньшей потерей гематопоэтического потенциала, чем у криоконсервированных PBSC в этом исследовании.

Дальнейшие попытки улучшить этот метод консервирования будут, если возможно, включать хранение клеток при гораздо более низких температурах, где биохимическое разрушение может быть сведено к минимуму. Для этого температура замерзания носителя должна быть достаточно низкой, чтобы избежать замерзания. Когда происходит замораживание внеклеточного раствора, это смертельно для сохраненных PBSC; по мере образования льда в растворе остающаяся внеклеточная жидкость становится высококонцентрированной, а повышенная осмоляльность вытягивает внутриклеточную воду из клетки.Следовательно, сохраненные клетки разрушаются, а их структуры разрушаются.

Температура замерзания среды зависит от ее осмоляльности. Прогнозируемая точка замерзания рассчитывается следующим образом: 18

Носители данных содержат некоторые осмотические вещества, такие как сахароза, и поэтому ожидается, что эти среды будут иметь повышенную осмоляльность и пониженную точку замерзания, что повысит эффективность хранения. Однако, чтобы снизить температуру замерзания носителя информации, нам необходимо отрегулировать раствор так, чтобы он стал чрезвычайно гиперосмотическим.Фактически, на каждые понижение точки замерзания на 1 ° C требуется повышение на 538 мОсм. Такой огромный осмотический стресс может повредить клетки, и, кроме того, предполагается, что осмотические вещества, увеличивающие осмоляльность раствора, медленно проникают в клетки во время хранения и приводят к набуханию клеток, вызванному высоким осмотическим давлением внутриклеточного пространства. 19 С этой точки зрения гиперосмолярные растворы считаются непригодными для хранения PBSC при минусовых температурах без замораживания.

С другой стороны, полезность сыворотки как компонента среды хранения была подчеркнута Grilli et al 20 при криоконсервации клеток костного мозга. Они подтвердили, что гомологичная сыворотка необходима для оптимальной криоконсервации стволовых клеток, потому что макромолекулы, такие как белки сыворотки, могут защитить стволовые клетки от травм во время фактического процесса замораживания-оттаивания. При хранении стволовых клеток в жидкости полезность сыворотки была также подтверждена Kohsaki et al , 12 , которые наблюдали более высокую выживаемость колониеобразующих клеток при добавлении больших количеств сыворотки в среду для хранения.В их исследовании клетки костного мозга хранили в альфа-среде с FCS, HEPES и CPD при 4 ° C. Эффект консерванта был значительно улучшен, когда FCS был увеличен с 20% до 40%. Хотя механизм, с помощью которого сыворотка проявляет свой консервантный эффект, все еще неизвестен, одним из возможных эффектов сыворотки является то, что сывороточный альбумин повышает коллоидное онкотическое давление носителей. Повышенное коллоидное онкотическое давление раствора приводит к дегидратации клеток, что снижает их набухание при хранении. 21 Исходя из этого, мы попытались улучшить результаты консервации, увеличив концентрацию альбумина в среде. Однако мы не обнаружили значительного увеличения консервативной способности при добавлении человеческого альбумина. Дальнейшее повышение концентрации альбумина может оказаться нецелесообразным.

Что касается скорости охлаждения в переохлажденном хранилище, есть некоторые проблемы, которые следует обсудить. Не было доказано, существуют ли какие-либо различия в эффективности консервантов между простым погружением при температурах переохлаждения и охлаждением с регулируемой скоростью.Переохлаждение с регулируемой скоростью может быть полезно для стабилизации переохлажденного состояния за счет предотвращения образования кристаллов льда в образцах.

На основании настоящих экспериментов мы пришли к выводу, что комбинация переохлаждения и раствора UW обеспечивает оптимальный метод хранения без замораживания для трансплантируемых PBSC. Этот метод должен иметь клиническое применение при PBSCT из-за его простоты и эффективности хранения, а также имеет ценность как метод краткосрочного хранения для PBSC для поддержки многоциклической химиотерапии с интенсивным дозированием.До настоящего времени с помощью этого метода нельзя было достичь периода консервации более 168 часов. Причины ухудшения состояния хранимых PBSC после длительного хранения неясны. Будет необходимо выяснить механизм, посредством которого PBSC повреждаются во время гипотермического хранения, и эта информация должна привести к дальнейшему улучшению сохранности PBSC.

Питательные вещества | Бесплатный полнотекстовый | Влияние замораживания на состав и функциональность кишечной микробиоты для экспериментов по ферментации in vitro

1.Введение

Известно, что микробиота кишечника влияет на здоровье хозяина, играя критическую роль в модуляции физиологических процессов, связанных с хроническими состояниями, такими как диабет II типа [1], колоректальный рак [2], ожирение [3], неврологические заболевания. расстройства [4], воспалительные заболевания кишечника [5], целиакия [6] или пищевая аллергия [7]. Поэтому возможность оптимизации микробиоты кишечника с помощью диеты и биологически активных соединений привлекла большое внимание. Однако эта задача имеет ряд проблем из-за сложности диеты, микробиома и физиологии человека и требует различных подходов, начиная от исследований in vivo и заканчивая исследованиями in vitro или in silico [8].В исследованиях микробиоты кишечника нет единого мнения, когда речь идет о лучших процедурах сбора и хранения образцов, протоколах ферментации in vitro, методах секвенирования или анализе данных. Тем не менее, важно соблюдать надлежащий протокол, обеспечивающий наиболее надежный результат [9]. Один из ключевых логистических шагов в исследованиях микробиома кишечника, который необходимо учитывать, — это то, как хранить фекальный материал. Авторы нашей библиографии согласны с тем, что к хранению фекалий добровольцев следует относиться осторожно, поскольку это может иметь сильное влияние на микробное сообщество [10].Влияние времени и температуры хранения на микробные сообщества фекалий широко изучалось у здоровых людей [10,11,12,13,14], пациентов с диабетом типа II [15] или воспалительным заболеванием кишечника [16,17]. ]. Замораживание пробы фекалий при –80 ° C вскоре после сбора, если требуется длительное время до анализа, считается «золотым стандартом» [10]. Однако были изучены и другие условия хранения, в частности, различные консервирующие растворы [18,19] или сублимационная сушка [20].Тем не менее, для консенсуса по трансплантации фекального материала (FMT) [21] «золотым стандартом» является хранение фекалий с глицерином в соотношении 50:50 при температуре -80 ° C, поскольку глицерин позволит сохранить структуру клетки. , что важно для FMT. Несмотря на это, авторы согласны с тем, что различия между людьми значительно превосходят эффекты, которые хранение может оказать на микробное сообщество. Это верно, когда анализируется только ДНК в фекальном материале, поскольку ДНК сохраняется в образце.Однако замораживание фекалий может иметь нежелательный эффект, если эти фекалии будут использоваться для ферментации in vitro, которая проводится для изучения того, как кишечные микробы метаболизируют определенные биоактивные соединения (например, фенольные соединения или клетчатку) или даже определенные продукты. Некоторые особо чувствительные бактерии могут погибнуть во время замораживания или не смогут возобновить свою метаболическую активность так же быстро, как другие, что потребует более длительного периода восстановления. Это может означать, что некоторые другие микробы могут превзойти их, что может изменить механизмы перекрестного питания и другие экологические взаимодействия.Следовательно, результирующее микробное сообщество могло отображать функциональность, сильно отличающуюся от той, которая была у него изначально. Однако этот вопрос очень мало изучен, и в настоящее время доступно очень мало информации. Fouhy et al. [12] выполнили культивирование на чашках общих аэробов, анаэробов и бифидобактерий и не обнаружили существенных различий между использованием свежих или замороженных фекалий при температуре –80 ° C. С другой стороны, в модели искусственной слизистой оболочки толстой кишки in vitro Deschamps et al. [14] действительно обнаружили различия на уровне микробных семей в зависимости от того, как хранились фекалии, хотя они использовали фекальный материал только от двух здоровых добровольцев.

Здесь, в рамках проекта Европейской комиссии Stance4Health, цель этой статьи — пролить свет на эту область путем изучения различий, вызванных использованием свежих или замороженных фекалий для целей ферментации in vitro, используя в качестве примера пищу чечевицу. . Чтобы лучше оценить, можно ли выявить разные результаты ферментационного анализа среди замороженных образцов от разных людей, мы использовали фекалии от четырех детей, один из которых был здоровым и худым, а у трех других была глютеновая болезнь, ожирение или аллергия на коровье молоко. соответственно.Предварительные результаты этого исследования помогут установить эффекты замораживания фекалий для целей ферментации in vitro, связанных с изучением либо конкретных биоактивных соединений, либо конкретных пищевых продуктов.

4. Обсуждение

Ферментация фекальной кишечной микробиоты in vitro является важным инструментом для изучения взаимосвязи между кишечной микробиотой, здоровьем человека и диетой (как цельными продуктами, так и биологически активными соединениями) [38,39]. Однако для проведения этих экспериментов часто невозможно использовать свежий фекальный материал по ряду причин: доноры не могут предоставить его вовремя, масштабы эксперимента не позволяют завершить его всего за один день. , и так далее.Поэтому лучшим решением будет заморозить каловые массы и разморозить их (не более одного раза) при необходимости. Фактически, «золотой стандарт» — хранить фекальный материал сразу после сбора при температуре –20 ° C или ниже [10]. Чтобы свести к минимуму повреждение бактериальных клеток во время замораживания, было предложено несколько протоколов и химикатов. Однако для трансплантации фекального материала (FMT) золотым стандартом считается замораживание фекального материала 20% глицерином в соотношении 50:50 вес / объем [21]. Действительно, несколько исследований демонстрируют, что после замораживания фекалий с помощью данного криопротектора сообщество фекальных микробов практически не изменяется или изменения не значительны.Однако эффективность криозащиты практически не изучалась для целей ферментации in vitro. Некоторые члены микробного сообщества, вероятно, пострадают от замораживания, и их рост впоследствии может быть нарушен или замедлен, а значит, и их метаболическая активность. Чтобы решить эту проблему, исследователи обычно стабилизируют микробное сообщество в сложной питательной среде для оживления бактерий в течение как минимум 24 часов. Однако это не меняет того факта, что некоторые микробы могли быть больше затронуты замораживанием, чем другие, и в среде для оживления их рост и метаболическая активность могут отставать от их конкурентов и других взаимодействующих микробов.Это будет означать, что экологические отношения внутри микробного сообщества могут измениться. Например, конкретный микроб, который не растет со своей обычной скоростью, может означать, что другой, обычно уступающий первому, растет с необычно более высокой скоростью; метаболиты перекрестного питания могут измениться и вызвать некоторые другие последствия для всего сообщества. В результате микробное сообщество, полученное после оживления, могло несколько отличаться от сообщества до замораживания. Соответственно, был проведен пилотный эксперимент, чтобы проверить, оказывает ли замораживание фекального материала значительное влияние на кишечное микробное сообщество для целей ферментации in vitro.Результаты показывают, как структура кишечного микробного сообщества, полученная после использования замороженного фекального материала, значительно отличалась, что продемонстрировали PCoA и db-RDA. Однако, основываясь на реакциях, которые, как было предсказано, присутствуют в бактериальных сообществах с использованием GMMR, сравнение свежих и замороженных образцов показало, что потенциальные функциональные возможности не были затронуты так сильно. Более того, влияние состояния (т. Е. Ожирения, худощавости, аллергии или целиакии) как на структуру, так и на функциональность кишечного микробного сообщества было выше, чем влияние замораживания фекального материала.Фактически, согласно db-RDA, замораживание фекалий существенно не повлияло на потенциальную функциональность. Мы провели OPLS-DA между свежими и замороженными образцами в каждом состоянии, чтобы найти наиболее дискриминантные микробы между этими образцами. В этом смысле особенно пострадал род Bacteroides. Этот род состоит из многих видов, и многие из них, как известно, играют важную роль в деградации волокон [37,40]. В то же время механизмы конкуренции [37] были описаны в пределах рода Bacteroides, когда речь идет о деградации волокон, а также о случаях сотрудничества и перекрестного питания.Данные предполагают, что замораживание может изменить рост некоторых микробов и тем самым изменить конкурентную среду и, таким образом, вызвать дальнейшие изменения в экологических отношениях, которые могут исказить структуру микробного сообщества.

С другой стороны, основанное на GMMR прогнозирование реакций, происходящих в микробных сообществах, предполагает, что замерзание фекального материала гораздо меньше повлияло на метаболический потенциал. Одна из возможных причин состоит в том, что функциональные возможности сложного микробного сообщества гораздо более надежны, чем фактическая структура, из-за функциональной избыточности.Как показано в разделе результатов, большинство затронутых реакций было восстановлено во время стабилизации, что указывает на то, что некоторым бактериям требуется период восстановления после замораживания. Однако есть некоторые реакции, которые остались отсутствовать после 5–6 дней стабилизации. Это может указывать на то, что некоторые виды бактерий либо нуждаются в более длительных периодах возрождения, либо не могут восстановиться после замораживания.

В заключение, представленные здесь данные предполагают, что замораживание фекального материала может привести к несколько иной структуре микробного сообщества кишечника, хотя функциональность сообщества в значительной степени сохраняется.Замораживание фекального материала действительно может нарушить рост некоторых бактерий, и, как следствие, на их месте могут расти другие конкурирующие бактерии, вызывая изменение других экологических отношений, таких как перекрестное кормление. Поэтому мы рекомендуем делать выбор между использованием свежего или замороженного фекального материала в зависимости от цели исследования. Свежий фекальный материал будет предпочтительнее, если исследователи хотят сосредоточиться на том, как ведет себя состав кишечной микробиоты. Тем не менее, тот факт, что вариация, вносимая замораживанием образца, меньше вариации, существующей среди людей, как до, так и после ферментации, указывает на то, что эксперименты по ферментации с замороженными образцами все еще могут быть информативными.Однако некоторые биоактивные соединения (например, фенольные соединения) метаболизируются очень специфическими видами, которые также обычно находятся в небольшом количестве [41]. Следовательно, если они будут потеряны во время замораживания, будет невозможно изучить эти конкретные метаболические процессы. С другой стороны, благодаря функциональной избыточности, большинство метаболических путей может осуществляться несколькими видами микробов, и, если цель работы не сосредоточена на конкретных микробах, фекальный материал может быть заморожен. Конкретные непереваренные остатки пищи или некоторые диетические компоненты (т.е., клетчатка, белки и т. д.) будут по-прежнему использоваться кишечными бактериями, и исследование с замороженным фекальным материалом может указать на те микробы или особенности, которые необходимо изучить в более конкретных экспериментах. Наконец, экологические взаимоотношения внутри микробного сообщества чрезвычайно сложны, и поэтому эти данные могут только предлагать возможные объяснения, и для подтверждения влияния замораживания на конкуренцию между бактериями и другие взаимодействия потребуются дальнейшие эксперименты с чистыми культурами и совместными культурами бактерий.

ячеек для замораживания и оттаивания в лаборатории: 8 советов и рекомендаций

Криоконсервация имеет решающее значение для длительного обслуживания клеток в лаборатории, поэтому важно, чтобы вы знали о процессе замораживания и оттаивания клеток.

Ни один даже самый прилежный и преданный своему делу ученый не в состоянии поддерживать линию клеток изо дня в день в течение многих лет.

Кроме того, клетки могут претерпевать генетические изменения, стареть или, ooops (!), Становиться контаминированными по мере увеличения продолжительности культивирования.Замораживание может защитить клетки от этих процессов.

Замораживание и оттаивание клеток можно легко осуществить с помощью всего лишь нескольких реагентов, а хранение клеток в жидкости N 2 обеспечит надежный источник клеток на протяжении всей карьеры.

Здесь мы проведем вас через все аспекты замораживания и оттаивания ячеек.

Ячейки для замораживания и оттаивания

Как заморозить клетки

Необходимые специальные материалы:

  • культивируемых клеток
  • среда для роста клеток
  • растворов для отделения клеток от планшета при использовании прикрепленных клеток (например,грамм. сбалансированный солевой раствор, трипсин / ЭДТА)
  • Диметилсульфоксид (ДМСО) степени чистоты для культуры ткани
  • плодная телячья сыворотка (ФБС)
  • криопробирки
  • камера замораживания ячеек
  • Морозильная камера –80 ° C
  • жидкость N 2 емкость для длительного хранения.
1. Пассажирские клетки

Здоровые, активно растущие клетки следует использовать для криоконсервации. Я всегда стараюсь заморозить большое количество клеток, которые не подвергались пересеву в культуру слишком много раз.

Я пасую клетки за 1-2 дня до замораживания, чтобы убедиться, что они находятся в логарифмической фазе роста во время замораживания.

Некоторые лаборатории рекомендуют менять питательную среду за 24 часа до замораживания, если в это время клетки еще не пассировали.

2. Подготовка ячеек

Удалите клетки из чашек, следуя обычному методу пассирования прилипших или суспензионных клеток. Объедините все ячейки и центрифуги.

3. Ресуспендируйте клетки в замораживающей среде и поместите аликвоты в криопробирки

Замораживание клеток может быть смертельным.Чтобы избежать повреждения, которое может быть вызвано, например, образованием кристаллов льда, осмотическим стрессом или повреждением мембраны, используется криопротектор для понижения точки замерзания клеток.

ДМСО в виде 10% основного раствора является наиболее часто используемым криопротектором.

Осторожно: при работе с ДМСО надевайте перчатки, так как он легко проникает через кожу.

Наиболее распространенная среда для замораживания — 90% FBS / 10% DMSO. Для менее привередливых клеток и для культурной ткани с ограниченным бюджетом также можно использовать 10% ДМСО в среде для роста клеток.

После центрифугирования ресуспендируйте осадок клеток в 1 мл замораживающей среды на криопробирку.

Убедитесь, что у вас есть криопробирки, предназначенные для хранения жидкости N 2 . Я обычно планирую на 1 чашку клеток 100 мм на криопробирку. Флаконы должны быть помечены лабораторным маркером, устойчивым к воздействию алкоголя и жидкости N 2 .

Будьте осторожны, указывая номера проходов / партий при маркировке криопробирок.

4. Морозильные камеры

Чтобы вода могла выйти из клеток перед замораживанием, замораживайте клетки медленно.Это достигается с помощью камеры замораживания клеток. Дорогие морозильные камеры периодически подают в жидкость N 2 для контроля скорости замораживания.

Менее дорогие варианты включают камеры, в которых используется изопропанол комнатной температуры. В камеру помещают флаконы, добавляют изопропанол и камеры помещают при –80 ° C как минимум на 4 часа.

Те из нас, у кого ограниченный бюджет (как я!), Используют самодельные камеры. Я сохраняю штативы из пенополистирола, которые поставляются с конусами на 15 мл, помещаю криопробирки в каждое отверстие, накрываю второй штативом, склеиваю штативы и устанавливаю при –80 ° C.

5. Не забудьте переместить клетки в жидкость N
2 Бак

Вероятно, одна из самых сложных вещей в этом протоколе — это не забыть переместить замороженные криопробирки в резервуар с жидкостью N 2 ! Я обычно даю своим клеткам замерзнуть на ночь, а затем быстро помещаю криопробирки в емкость с жидкостью N 2 .

Как разморозить клетки

Необходимые специальные материалы:

1. Извлеките клетки из резервуара и разморозьте

Для максимальной жизнеспособности клеток важно медленно замораживать клетки.Обратное верно для оттаивания — оттаять быстро! Извлеките криопробирки из резервуара с жидкостью N 2 и немедленно поместите их в водяную баню с температурой 37 ° C.

Держите криопробирки на водяной бане до тех пор, пока в криопробирке не останется мельчайший кристалл льда.

2. Перенос, отжим (?) И пластина

Немедленно перенесите клетки в большой объем предварительно подогретой среды для роста клеток (аликвота клеток ~ 10 мл / 1 мл). Для следующего шага вам нужно принять решение.

Существует две точки зрения о том, следует ли немедленно удалять криопротектор из клеток:

  1. В некоторых лабораториях клетки центрифугируют, а осадок клеток ресуспендируют в свежей среде для роста клеток перед помещением клеток в чашку для культивирования.Так я впервые научился оттаивать клетки.
  2. Однако некоторые данные предполагают, что клетки становятся чрезвычайно хрупкими после оттаивания и что центрифугирование может увеличить гибель клеток. Поэтому рекомендуется высеять клетки и заменить питательную среду позже.

Для прикрепившихся клеток вы можете изменить среду, как только клетки прикрепятся к чашке.

Я перешел на этот метод и теперь обычно беру свои клетки перед тем, как покинуть лабораторию на ночь, а на следующее утро первым делом меняю среду.

3. Проверьте свои клетки

Примерно через 24 часа после оттаивания я внимательно изучаю свои клетки под микроскопом, чтобы убедиться, что они здоровы и ведут себя нормально.

Сводка

Эффективное замораживание и размораживание клеток избавит вас от смущения, связанного с запросом у коллеги еще одной аликвоты их клеток, или от затрат на покупку новых клеток.

И если ничего не помогает, не забудьте медленно заморозить и быстро оттаять! Подробнее о криоконсервации читайте в нашей статье о сохранении микроорганизмов.Дайте нам знать о ваших главных советах по замораживанию и оттаиванию ячеек!

Первоначально опубликовано 3 апреля 2013 г. Проверено и обновлено в мае 2021 г.

Вам это помогло? Тогда поделитесь, пожалуйста, со своей сетью.

Криоконсервация клеток млекопитающих | Thermo Fisher Scientific

Клетки млекопитающих криоконсервированы, чтобы избежать потери из-за контаминации, минимизировать генетические изменения в непрерывных клеточных линиях и избежать старения и трансформации конечных клеточных линий.Перед криоконсервацией клетки следует охарактеризовать и проверить на загрязнение. Для замораживания клеток обычно используют несколько сред.

Для среды, содержащей сыворотку, компоненты могут быть следующими:

  • полная среда, содержащая 10% глицерина
  • полная среда, содержащая 10% ДМСО (диметилсульфоксид)
  • 50% кондиционированная среда с 50% свежей среда с 10% глицерина или 10% ДМСО

Среда для криоконсервации обычно состоит из базовой среды, криоконсерванта и источника белка.Криоконсервант и белок защищают клетки от стресса в процессе замораживания-оттаивания. Бессывороточная среда обычно имеет низкий уровень белка или вообще не имеет белка; но вы все равно можете использовать его в качестве основы для криоконсервативной среды в следующих составах:

Для бессывороточной среды некоторые из распространенных компонентов среды могут быть:

  • Бессывороточная среда, кондиционированная на 50%. с 50% свежей бессывороточной средой, содержащей 7,5% ДМСО
  • свежей бессывороточной средой, содержащей 7.5% ДМСО и 10% БСА для культур клеток.

Протокол: суспензионные культуры

  1. Подсчитайте количество жизнеспособных клеток, подлежащих криоконсервации. Ячейки должны быть в фазе журнала. Центрифуга клеток при ~ 200-400 х g в течение 5 мин для осаждения клеток. С помощью пипетки удалите надосадочную жидкость до наименьшего объема, не трогая клетки.
  2. Ресуспендируйте клетки в замораживающей среде до концентрации от 1 x 10 7 до 5 x 10 7 клеток / мл для среды, содержащей сыворотку, или 0.5 x 10 7 до 1 x 10 7 клеток / мл для бессывороточной среды.
  3. Аликвотирование в криогенные флаконы для хранения. Поместите флаконы на влажный лед или в холодильник с температурой 4 ° C и начните процедуру замораживания в течение 5 минут.
  4. Клетки замораживают медленно со скоростью 1 ° C / мин. Этого можно достичь, используя программируемый охладитель или поместив флаконы в изолированную коробку, помещенную в морозильную камеру от –70 ° C до –90 ° C, а затем переместив их в хранилище с жидким азотом.

Протокол: адгезивные культуры

  1. Отделите клетки от субстрата с помощью агентов диссоциации.Снимите как можно осторожнее, чтобы свести к минимуму повреждение клеток.
  2. Ресуспендируйте отделенные клетки в полной ростовой среде и установите количество жизнеспособных клеток.
  3. Центрифуга при ~ 200 x g в течение 5 мин для осаждения клеток. С помощью пипетки отберите надосадочную жидкость до наименьшего объема, не трогая клетки.
  4. Ресуспендируйте клетки в замораживающей среде до концентрации от 5 x 10 6 до 1 x 10 7 клеток / мл.
  5. Аликвотирование в криогенные флаконы для хранения.Поместите флаконы на влажный лед или в холодильник с температурой 4 ° C и начните процедуру замораживания в течение 5 минут.
  6. Клетки следует замораживать медленно со скоростью 1 ° C / мин. Этого можно достичь, используя программируемый охладитель или поместив флаконы в изолированную коробку, помещенную в морозильную камеру от –70 ° C до –90 ° C, а затем переместив их в хранилище с жидким азотом.

Ссылка:

  1. Freshney, R. (1987) Культура клеток животных: Руководство по базовой технике, стр. 220, Алан Р. Лисс, Инк., Нью-Йорк.


Чтобы разморозить криоконсервированные клетки, см. Этот протокол

Влияние замораживания на корма | Master Grazer

Отравление синильной кислотой (цианидом)

По мере того, как температура продолжает снижаться, важно знать и понимать, как различные виды кормов реагируют на заморозки и заморозки, чтобы наилучшим образом использовать эти корма и избежать возможных проблем со здоровьем . Замораживание изменяет метаболизм и состав растений. В зависимости от вида растений это может привести к возможным заболеваниям животных, связанным с кормом, или к необходимости изменить методы управления пастбищами.

Такие растения, как сорго, суданграсс, сорго-суданские гибриды, джонсонграсс, дикая вишня и другие, содержат соединения, продуцирующие цианиды. Когда эти растения повреждены морозом или засухой, в результате реакции образуется большее количество цианида. Важно проявлять особую осторожность при выпасе этих видов в неблагоприятных условиях. Почвы с высоким содержанием азота и низким содержанием фосфора имеют больший потенциал образования вредных уровней цианида. Листья, новые побеги и побеги содержат более высокий уровень цианида. Если есть неубивающий мороз, подождите 10–14 дней без дополнительного воздействия мороза перед выпасом.После сильного мороза рекомендуется не пускать скот на эти пастбища в течение трех дней.

При потреблении большого количества цианида, часто называемого синильной кислотой, это соединение препятствует использованию кислорода, и домашний скот может умереть от паралича дыхательных путей. Симптомы появляются быстро после употребления корма. Эти симптомы могут включать кровь вишнево-красного цвета, шатание, затрудненное дыхание, судороги, пену изо рта, падение, удары, тяжелые судороги и смерть. Чтобы спасти скот, страдающий от отравления цианидом, необходимо немедленно обратиться к ветеринару.

При скашивании на сено содержание цианида значительно снижается в процессе посола. Изрядное количество этого яда улетучивается в виде газа во время ферментации при использовании для силоса. Хотя обычно кормить эти виды сеном или силосом безопасно, важно соблюдать осторожность при выпасе любого корма, который потенциально может содержать высокие уровни цианида.

Соблюдение осторожности при выпасе этих кормов во время стресса обычно может исключить возможность отравления цианидом домашнего скота.Подождите рекомендованное время перед выпасом после заморозков. Добавление в рацион неопасных кормов также может быть полезным. Использование «подопытных» животных — это еще один вариант, а не превращение всего стада в поле.

Риск отравления цианидом в этом сезоне можно снизить, следуя этим методам:

  • Подождите 10-14 дней после неубивающего мороза без дополнительных мер воздействия мороза перед выпасом.
  • Не пастись после смертельного мороза, пока растительный материал не высохнет (токсин обычно рассеивается в течение 72 часов.)
  • Не пасайтесь ночью, когда возможны морозы. Высокий уровень токсинов вырабатывается в течение нескольких часов после наступления заморозков.
  • Отсрочка кормления силосом на шесть-восемь недель после силоса.

См. Http://www.uky.edu/Ag/Forage/GL%20ASC-57.pdf для получения дополнительной информации о нарушениях в животноводстве, связанных с кормом.

Влияние замораживания на люцерну

Замораживание влияет на несколько других широко используемых кормов, включая люцерну, что может повлиять на лучшие стратегии управления.Хотя люцерна, поврежденная морозом, не токсична, важно соблюдать осторожность при выпасе люцерны после сильного замораживания (менее 25 ° F). После замораживания угроза вздутия в течение нескольких дней незначительно увеличивается. Когда начинается увядание или растение снова начинает расти, вероятность вздутия уменьшается. Подождите несколько дней после замораживания, чтобы снизить риск вздутия живота при выпасе люцерны. Продолжайте использовать рекомендованные методы, чтобы уменьшить вероятность вздутия живота. Если необходим корм и вы планируете срезать люцерну для сена, рекомендуется подождать, чтобы срезать ее до первого сильного замораживания или до начала-середины ноября (даже без замораживания после этой даты отрастание будет очень незначительным).После сильного замораживания разрежьте как можно скорее, чтобы снизить потерю питательной ценности. Если срезать после заморозки, не вызывающей смертельного исхода, растения могут начать отрастать, которые будут использовать накопленные углеводы, которые в противном случае использовались бы для перезимовки и весеннего отрастания.

Выпас овсяницы высокорослой после заморозки

Морозы значительно снижают качество кормов для большинства кормовых видов. Овсяница высокорослая уникальна тем, что имеет восковой слой, который уменьшает ущерб от более низких температур, а качество корма остается высоким по сравнению с другими видами.Потеря качества из-за порчи листьев ниже по сравнению с другими кормами в холодное время года. Еще одним уникальным свойством овсяницы высокорослой является то, что после замораживания содержание сахара увеличивается. Это делает овсяницу высокорослой идеальной для хранения и зимнего выпаса.

Соблюдайте осторожность при выпасе определенных трав теплого сезона после заморозков, чтобы снизить риск отравления цианидом (синильной кислотой).

Предотвращение и размораживание замороженных труб

Предотвращение и размораживание замороженных труб | Американский Красный Крест