Лада cng: LADA Vesta CNG на природном газе (метане) – Обзор – Официальный сайт LADA

Измерения флуоресценции нескольких субъединиц CNGB1

Чтобы напрямую измерить присутствие нескольких субъединиц CNGB1 в канале, мы обратились к подходу, основанному на передаче резонансной энергии флуоресценции (FRET) ²³ .FRET сообщает о близости двух флуорофоров на основе эффективности передачи энергии между донорным флуорофором и акцепторным флуорофором. FRET можно обнаружить по усиленному излучению флуоресценции акцептора при возбуждении донора. Голубой флуоресцентный белок (eCFP) и желтый флуоресцентный белок (eYFP) представляют собой генетически кодируемые донорные и акцепторные флуорофоры, соответственно, которые могут быть слиты с представляющими интерес белками ²⁴ . Они демонстрируют передачу 50% энергии на расстоянии около 50 Å и измеримую передачу до 80 Å (см.25), что делает их идеальными для измерения субъединичного состава ⁷ . Ранее было показано, что если субъединицы CNGA1 сливаются с eCFP и eYFP (индивидуально) и коэкспрессируются с субъединицами CNGB1 в ооцитах Xenopus , имеется значительный FRET для каналов в плазматической мембране ⁷ . Однако, если субъединицы CNGB1 были слиты с eCFP и eYFP и коэкспрессированы с субъединицами CNGA1, FRET практически отсутствовал (рис. 4a). Эти результаты показали, что гетеромерные стержневые каналы CNG в плазматической мембране содержат несколько субъединиц CNGA1, но только одну субъединицу CNGB1 (стехиометрия 3: 1).

( a ) Прогнозы для FRET между eCFP-CNGB1-ΔN и eYFP-CNGB1-ΔN для каналов, содержащих только одну субъединицу CNGB1 (слева) или, возможно, несколько субъединиц (справа). Возможности FRET показаны стрелками. ( b ) Спектры излучения ооцитов Xenopus , экспрессирующих CNGA1-ΔCLZ с eCFP-CNGB1-ΔN и eYFP-CNGB1-ΔN с возбуждением 458 нм (красный) или возбуждением 488 нм (черный).Масштабированное возбуждение только для eCFP показано синим цветом, а выделенный спектр (разница между красным и синим) показан желтым цветом. Отношение A — это отношение желтого к черному спектру. ( c ) Спектры излучения CNGA1-ΔCLZ + eYFP-CNGB1-ΔN, окрашенные как в ( b ). Отношение Ao — это отношение красного спектра к черному. ( d ) Соотношение A-Ratio Ao для FRET между субъединицами CNGB1 с ( n = 8) и без ( n = 6) домена CLZ в субъединице CNGA1. ( e ) Соотношение A-Ratio Ao для FRET между субъединицами CNGA1 и CNGB1 с ( n = 6) и без ( n = 4) домена CLZ в субъединице CNGA1.Данные представлены как среднее ± s.e.m. Звездочки указывают на статистически значимые различия, при P <0,05.

Мы провели аналогичный эксперимент, чтобы определить, допускает ли делеция домена CLZ включение нескольких субъединиц CNGB1 в гетеромерные каналы. Если имеется несколько субъединиц CNGB1 в гетеромерных каналах, то мы должны наблюдать FRET между субъединицами CNGB1, когда они слиты с eCFP и eYFP и коэкспрессируются с субъединицами CNGA1-ΔCLZ (Fig. 4a). Для этих экспериментов мы слили eCFP и eYFP (индивидуально) с аминоконцевым концом CNGB1-ΔN (eCFP-CNGB1-ΔN и eYFP-CNGB1-ΔN соответственно).Конструкции слияния eCFP и eYFP проявляли функциональные свойства, неотличимые от их неслитых аналогов (данные не показаны). Поскольку аминоконцевая область в этой субъединице удалена, флуоресцентные белки должны находиться рядом с внутренним листком мембраны, рядом с трансмембранным сегментом S1. Основываясь на структуре родственного канала Kv1.2 ²⁶ , два флуоресцентных белка в одном канале должны находиться на расстоянии около 56 Å (при условии, что они находятся в соседних субъединицах) или 79 Å (при условии, что они находятся в несмежных субъединицах).

Типичные результаты совместной экспрессии CNGA1-ΔCLZ с eCFP-CNGB1-ΔN и eYFP-CNGB1-ΔN показаны на рисунке 4b. FRET измеряли по сенсибилизированному излучению акцептора с использованием спектров флуоресценции ²³ . Спектры излучения флуоресценции из каналов в плазматической мембране или вблизи нее живых ооцитов Xenopus измеряли с помощью конфокальной микроскопии. Возбуждение eCFP лазером с длиной волны 458 нм дает сложный спектр излучения (красная кривая) с компонентами излучения как eCFP, так и eYFP.Компонент eYFP (оранжевая кривая) был извлечен путем вычитания масштабированного спектра излучения только из eCFP (синяя кривая). Этот выделенный спектр содержит излучение eYFP как от FRET, так и от прямого возбуждения eYFP светом 458 нм. Чтобы выделить компонент, обусловленный FRET, фракционное возбуждение eYFP светом 458 нм относительно света 488 нм (отношение Ao) (рис. 4c, методы) вычитали из соответствующего фракционного возбуждения для каналов, содержащих eCFP и eYFP (отношение A ). Соотношение A-Ratio Ao прямо пропорционально эффективности FRET ²³ .Как показано на фиг. 4d, соотношение A-Ratio Ao было значительно больше с CNGA1-ΔCLZ, чем с CNGA1, когда субъединица CNGA1 коэкспрессировалась вместе с флуоресцентным CNGB1. Эти результаты напрямую демонстрируют, что удаление домена CLZ вызывает сборку множества субъединиц CNGB1.

Возможное альтернативное объяснение FRET, наблюдаемого между субъединицами CNGB1 с делецией домена CNGA1 CLZ, состоит в том, что субъединицы CNGB1 образуют гомомерные каналы на низких уровнях. Действительно, флуоресценция значительно тусклее при совместной экспрессии CNGA1-ΔCLZ, чем при совместной экспрессии CNGA1.Ранее, однако, было показано, что в отсутствие CNGA1 субъединицы CNGB1 не образуют функциональных гомомерных каналов и очень слабо экспрессируются в плазматической мембране ^9,17 . Сходным образом мы обнаружили, что в отсутствие субъединицы CNGA1 как CNGB1, так и CNGB1-ΔN не продуцируют детектируемые токи и плохо экспрессируются в плазматической мембране (дополнительный рис. S1). Кроме того, ранее было показано, что субъединицы CNGB1, экспрессируемые сами по себе, не обнаруживают заметного FRET ⁹ .Это делает маловероятным, что увеличение FRET, наблюдаемое между субъединицами CNGB1 с делецией домена CNGA1 CLZ, происходит от субъединиц CNGB1, образующих гомомерные каналы.

Тем не менее, чтобы доказать, что множественные субъединицы CNGB1 собираются совместно с субъединицами CNGA1-ΔCLZ, мы исследовали FRET между субъединицами CNGA и CNGB. Для акцепторной сенсибилизации очевидная эффективность FRET увеличивается по мере увеличения отношения донора к акцептору ²⁷ . Следовательно, если донорный флуорофор (eCFP) был слит с субъединицей CNGB, а акцепторный флуорофор (eYFP) был слит с субъединицей CNGA, то увеличение видимого FRET должно наблюдаться, если несколько субъединиц CNGB1 собраны в канальный комплекс (дополнительный рис. .S2). Действительно, результаты показывают значительное увеличение FRET между eCFP-CNGB1-ΔN и eYFP-CNGA1-ΔCLZ по сравнению с eYFP-CNGA1 (рис. 4e). Эти результаты показывают, что несколько субъединиц CNGB1 собираются совместно с субъединицами CNGA1-ΔCLZ. В целом очевидно, что удаление домена CLZ ослабляет ограничение 3: 1 на сборку субъединиц.

Домены CLZ CNGA1 и CNGA3 образуют тримеры в растворе

Приведенные выше результаты предполагают, что домен CLZ играет важную роль в ограничении стехиометрии стержневых каналов CNG до 3: 1 субъединиц CNGA1: CNGB1.Ранее было показано, что фрагмент белка, содержащий домен CLZ из конуса CNGA3, образует гомотипические тримеры в растворе ⁸ . Чтобы определить, будет ли домен CLZ из CNGA1 также образовывать тримеры, и чтобы локализовать вовлеченную область, мы провели скрининг ряда карбоксиконцевых фрагментов как CNGA1, так и CNGA3, используя эксклюзионную хроматографию с детектированием флуоресценции (FSEC) (дополнительный рисунок S3). ) ²⁸ . Фрагменты белка экспрессировались в бактериях как N-концевые (NGFP) или C-концевые (CGFP) слияния с GFP.После лизиса клеток неочищенный супернатант затем загружали в систему эксклюзионной хроматографии с встроенным детектором флуоресценции. Все экспрессирующие фрагменты, содержащие домен CLZ, показали заметный компонент, который элюировался при 13 мл, что соответствовало образованию тримеров (фиг. 5a). Для проверки состава высокомолекулярного компонента образцы очищенного белка после расщепления GFP анализировали с помощью эксклюзионной хроматографии с рассеянием света (LS-SEC) (рис.5б) ^29,30 . Как для CNGA1, так и для CNGA3 молекулярные массы, определенные с помощью LS-SEC, находились в пределах примерно 1% от прогнозируемых молекулярных масс для тримера (таблица 1). Сходные результаты с меньшими фрагментами выявили минимальный фрагмент, соответствующий домену CLZ, который формирует тримеры как в субъединицах CNGA1 (аминокислоты 621–667), так и в CNGA3 (626–672).

( a ) Результаты FSEC для CNGA1 № 621–690 (слева) и CNGA3 № 626–694 (справа) как N-концевой (красный) и C-концевой (черный) слияния с GFP.Пики, элюирующие при 13 мл, представляют собой прогнозируемый размер тримера гибридных белков. ( b ) Результаты LS-SEC для CNGA1 № 621–690 (синий) и CNGA3 № 626–694 (пурпурный). Гладкие кривые показывают элюцию белка (поглощение ультрафиолетового излучения), а точки данных показывают измеренную молекулярную массу (левая ось).

Рентгеновская кристаллография выявляет трехспиральный домен со спиральной спиралью

Последовательность домена CLZ демонстрирует периодические гептадные повторы (a-b-c-d-e-f-g) _n , в которых положения ‘a’ и ‘d’ являются гидрофобными остатками (рис.1б) ⁸ . Этот мотив характерен для доменов типа coiled-coil ^31,32 . В каждой последовательности есть два несмежных участка гептадного повтора; у первого три повтора, а у второго — два. Две области не совпадают, и позиция «a» первой области становится позицией «d» второй области. В то время как присутствие гептадных повторов довольно указывает на домены coiled-coil, на основе одной только последовательности трудно определить олигомерное состояние, параллельное или антипараллельное расположение и детали упаковки coiled-coil и поверхностной архитектуры ³² .Эти свойства имеют прямое отношение к механизму сборки, интерпретации мутаций и взаимодействию с другими белками или доменами. По этим причинам мы были заинтересованы в получении структуры CLZ-доменов с высоким разрешением.

Мы решили рентгеновские кристаллические структуры с высоким разрешением CLZ доменов как CNGA1, так и CNGA3. Белки были экспрессированы и очищены из лизатов бактериальных клеток и кристаллизованы при диффузии пара. Кристаллы CNGA1 № 621–690 выросли в пространственной группе P2 ₁ 2 ₁ 2 ₁ с тремя молекулами в асимметричной единице и дифрагировали до 2.14 Å. Структура CNGA1 # 621–690 была решена с использованием молекулярной замены со структурой области кармана N-тримеров gp41 ВИЧ ³³ (3L36) в качестве зонда поиска (дополнительная таблица S1). Структура CNGA3 # 626–672 в пространственной группе P12 ₁ 1 была решена до 1,9 Å с использованием молекулярной замены структурой белка S2 вируса SARS ³⁴ (1ZVB) в качестве зонда поиска (дополнительная таблица S1).

Структуры обоих CNGA1 № 621–690 и CNGA3 № 626–672 состояли из длинных (65 Å) параллельных трехспиральных доменов coiled-coil (рис.6). Последовательность за пределами домена CLZ в CNGA1 (аминокислоты 665–675 для цепи A; 665–676 для цепи B и 665–670 для цепи C) расширяется наружу и частично участвует во взаимодействиях упаковки кристаллов (Supplementary Fig. S4). Кроме того, структура CNGA1 # 621–690 содержала два связанных тяжелых атома на тример с электронной плотностью более 10 сигма (рис. 6; дополнительный рис. S5). Эти тяжелые атомы координировались кислотными остатками (E629 и D633 для проксимального сайта и E671 и E623 для дистального иона) на границе раздела между различными тримерами в кристалле и, следовательно, считаются нефизиологическими (дополнительный рис.S5). Скорее всего, это ионы Zn ²⁺ из-за их координации и потребности в Zn ²⁺ в кристаллизационном растворе для получения кристаллов.

Ленточное изображение тримерных спиральных структур CNGA1 № 621–690 ( a ) и CNGA3 № 626–672 ( b ). Каждый комплекс показан в боковой (слева) и верхней (правой) перспективе (вверху, N-конец; внизу, C-конец).Ионы металлов, координированные остатками глутамата и аспартата в двух сайтах в CNGA1 # 621–690, показаны желтыми сферами.

Упаковка доменов спиральной катушки следовала характерному расположению «выступов в отверстия» с положениями «а» и «d», формируя чередующиеся слои гидрофобного ядра спиральной катушки (рис. 7) ^32,35 . Две несмежные области гептадного повтора собраны в единую непрерывную спиральную спираль. Интересно, что структуры CNGA1 и CNGA3 различались по длине двух участков гептадного повтора.Для CNGA1 первая область содержала 3 гептадных повтора, а вторая — 3,5 повтора (рис. 7b). Для CNGA3 первая область содержала 4 гептадных повтора, а вторая — 2,5 повтора (рис. 7c). Разница, по-видимому, заключается в замене изолейцина на лейцин после третьего гептадного повтора в CNGA1 (рис. 1b).

( a ) Гидрофобные слои CNGA1 № 621–690 (слева) и CNGA3 № 626–672 (справа).Боковые цепи изображены для положений «a» (красный) и «d» (синий) намотанных катушек. ( b , c ) Геометрия уплотнения для положений «a» (красный) и «d» (синий) для CNGA1 № 621–690 ( b ) и CNGA3 № 626–672 ( c ).

Хотя структуры CNGA1 и CNGA3 в целом были похожи, они не были идентичными. Как указано выше, в спиральной упаковке между двумя участками гептадного повтора в последовательности использовали разные положения остатков. Кроме того, суперспирализация различалась между CNGA1 и CNGA3, с несколько более длинным шагом для CNGA1 (181 Å), чем для CNGA3 (149 Å) (дополнительная таблица S2).Эти различия были также отражены в структурном выравнивании отдельных субъединиц CNGA1 и CNGA3 (среднеквадратичное отклонение Cα в диапазоне от 0,87 до 2,0 Å). Однако эти различия в структуре не имеют каких-либо известных функциональных последствий.

Взаимодействие кальмодулина с hEAG1, визуализированное с помощью микроскопии FRET

Абстрактные

Фон

Ca ²⁺ -опосредованная регуляция ионных каналов обеспечивает связь между внутриклеточными сигнальными путями и электрической активностью мембраны.Внутриклеточный Ca ²⁺ ингибирует потенциал-зависимый калиевый канал EAG1 посредством прямого связывания кальмодулина (CaM). Три сайта связывания CaM (BD-C1: 674-683, BD-C2: 711-721, BD-N: 151-165) были идентифицированы при скрининге пептидов, и было предложено опосредовать связывание. Однако участие трех сайтов в связывании CaM с нативным каналом остается неясным.

Методология / основные выводы

Здесь мы изучили связывание Ca ²⁺ / CaM с каналом EAG, визуализировав взаимодействие между меченным YFP CaM и меченным церулеаном hEAG1 в клетках млекопитающих с помощью FRET.Результаты нашего клеточного подхода подтверждают, что преимущественно задействованы два сайта связывания CaM; высокоаффинный связывающий домен 1-8-14 на основе CaM на N-конце и второй C-концевой связывающий домен BD-C2. Мутации в этих сайтах полностью устраняют связывание CaM с hEAG1.

Выводы / Значение

Мы продемонстрировали, что связывающих доменов BD-N и BD-C2 достаточно для связывания CaM с нативным каналом, и, следовательно, что BD-C1 не может независимо связывать CaM.

Образец цитирования: Gonçalves JT, Stühmer W (2010) Взаимодействие кальмодулина с hEAG1, визуализированное с помощью микроскопии FRET. PLoS ONE 5 (5): e10873. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010873

Редактор: Ричард Стейнхардт, Калифорнийский университет, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 8 января 2010 г .; Дата принятия: 4 мая 2010 г .; Опубликовано: 27 мая 2010 г.

Авторские права: © 2010 Gonçalves, Stühmer.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft (www.dfg.de) через следующие программы финансирования: Sonderforschungsbereich 406, Graduiertenkolleg 723 и Центр молекулярной физиологии мозга. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Каналы Ether-à-go-go (EAG) опосредуют выпрямляющие внутрь калиевые токи с активацией, близкой к потенциалу покоя мембраны. Сообщается, что они модулируются внутриклеточными уровнями Ca ²⁺ [1], [2], что, вероятно, играет роль в их предполагаемых функциях в пролиферации [3], дифференцировке (слияние миобластов) [4] и регуляция нейрональной активности [5], [6], [7].

каналов EAG являются членами-основателями семейства KCNH или ether-a-go-go, связанных с напряжением каналов K ⁺ [8]. Каналы семейства EAG структурно характеризуются наличием высококонсервативного домена EAG или PAS (Per-Arnt-Sim) на их N-концах [9]. Однако их токи могут значительно отличаться от токов EAG1 или EAG2. Функциональные каналы EAG представляют собой тетрамеры, и было показано, что как hEAG1, так и hEAG2 образуют функциональные гетеротетрамеры при совместной экспрессии [10].Субъединицы канала EAG представляют собой многопроходные мембранные белки с шестью трансмембранными сегментами (S1-S6) и внутриклеточными хвостами на N- и C-концах, стандартная топология, общая для других потенциалзависимых каналов K ⁺ [11]. Цитоплазматические области на N- и C-концах канала составляют более 70% аминокислотной последовательности и содержат несколько функциональных доменов. N-конец включает домен связывания CaM (BD-N) и домен PAS. Последний, по-видимому, играет роль в закрытии каналов, связываясь с внутриклеточной петлей S4-S5 [9], [12].Цитоплазматический C-концевой участок содержит четыре регуляторных домена — предполагаемый и, по-видимому, нефункциональный, связывающий домен циклических нуклеотидов (cNMP) [13], [14], два CaM-связывающих домена (BD-C1 и BD-C2) и один домен, опосредующий тетрамеризацию [15], [16].

hEAG1 ингибируется Ca ²⁺ , обнаруживая полумаксимальное ингибирование при концентрации Ca ²⁺ ~ 100 нМ [1], [2]. Это означает, что активность канала EAG ингибируется чуть выше покоящихся уровней Ca ²⁺ .Первоначально Schönherr et al. [17] сообщили, что ингибирование hEAG1 Ca ²⁺ опосредовано прямым связыванием Ca ²⁺ / CaM с С-концом (AA 707-726) канала. Этот участок остатков несет предполагаемую амфифильную СаМ-связывающую спираль (BD-C2: 711-720). Совсем недавно с использованием метода сканирования пептидов были обнаружены еще два предполагаемых домена связывания CaM [18], один в N- (BD-N: AA 151–165), а другой — на C-конце (BD-C1: AA 674– 683) из hEAG1. Сообщалось, что мутации в каждом из этих доменов нарушают ингибирование токов hEAG1 с помощью Ca ²⁺ .В настоящее время мало что известно о вкладе BD-C1 в связывание CaM. Анализ аффинности флуоресцентной корреляционной спектроскопии (FCS) показал, что связывание CaM с этим сайтом имеет более низкое сродство по сравнению с другими сайтами [18], что вызывает сомнения относительно того, действительно ли он связывает CaM или просто способствует связыванию CaM с BD-C2. Такая неоднозначность результатов биохимических анализов белков, взаимодействующих с ионными каналами, не редкость. Обычно анализируются только цитозольные части каналов, и они могут не приобретать конформацию нативного тетрамерного канала, встроенного в мембрану.По этим причинам и в отличие от предыдущих скринингов, мы разработали анализ, основанный на передаче энергии резонанса Фёрстера (FRET), для непосредственного исследования связывания CaM с полноразмерным каналом hEAG1 в клетках. Мы показываем, что BD-C1 не может самостоятельно связывать CaM с каналом и что достаточно связывания с N-концом и C-концом BD-C2.

Методы

Конструирование плазмид и мутагенез

C-концевые слитые конструкции с церулеаном и YFP полноразмерного hEAG1 были созданы путем клонирования кДНК hEAG1 в вектор CB6 с использованием сайтов рестрикции KpnI и NotI.Cerulean и YFP были клонированы на C-конце hEAG1 с помощью ПЦР с использованием сайтов NotI и BamHI. Слитые конструкции Cerulean- и YFP-C-конца hEAG1 клонировали путем амплификации сегмента M478-S962 hEAG1 с помощью ПЦР и вставки его между сайтами BamHI и NotI вектора pcDNA3 (Invitrogen). Затем Cerulean и YFP амплифицировали с помощью ПЦР с фланкирующими сайтами NotI и вставляли ниже C-конца hEAG1.

Слитая конструкция глутатион-S-трансферазы (GST) N-конца rEAG1 была получена путем ПЦР-амплификации фрагмента AA 1-219 и последующего субклонирования между сайтами рестрикции BamHI и NotI в векторе pGEX-4T-1 (Pharmacia / GE Healthcare).

кДНК для кальмодулина II крысы амплифицировали с помощью ПЦР с фланкирующими сайтами рестрикции NotI и клонировали в вектор CB6-N-YFP для получения кальмодулина, меченного YFP на N-конце (YFP-CaM). Точечные мутации в сайтах связывания CaM крысиного и человеческого EAG1 были созданы с использованием набора для мутагенеза QuickChange XL на основе ПЦР (Stratagene). Все конструкции были проверены секвенированием.

Cerulean был любезно предоставлен Д. Пистоном, Университет Вандербильта, Нэшвилл, Теннесси, США, вектор YFP-CB6 [19] был любезным подарком от М.Way, Cancer Research UK, Лондон, Великобритания, кДНК для крысиного кальмодулина II была любезно предоставлена ​​Т. М. Ши, Университет штата Айова, Айова-Сити, Айова, США, и YFP-апо-кальмодулин (YFP-apoCaM [20]) был подарком Д. Юэ, Университет Джона Хопкинса, Балтимор, Мэриленд, США. Мутации во всех доменах EF-hand делают эту версию CaM нечувствительной к Ca ²⁺ .

Культура клеток и трансфекция

клеток HEK-293 культивировали в среде DMEM: F12 (1-1) (Gibco) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки и 0.1% стрептомицин / пенициллин (Gibco) в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ при 37 ° C. Клетки высевали на покровные стекла, покрытые поли-L-лизином, и трансфицировали при 20-30% конфлюэнтности с использованием FuGene6 (Roche) в соответствии с инструкциями производителя. Общее количество использованной кДНК составляло 0,5 мкг на покровное стекло толщиной 15 мм. Для котрансфекций использовали соотношение кДНК hEAG1: CaM 3-1 (м / м).

Ca

Для измерения FRET связывания CaM клетки обрабатывали через 36 часов после трансфекции 1 мкМ иономицином (Calbiochem) в любом растворе Рингера, содержащем Ca ²⁺ (145 мМ NaCl, 25 мМ HEPES pH 7.4, 5,4 мМ KCl, 5 мМ глюкоза, 1,8 мМ CaCl ₂ , 1 мМ NaH ₂ PO ₄ , 0,8 мМ MgSO ₄ — обозначается «+ Ca ²⁺ ») или Ca ²⁺ — и Mg ²⁺ -свободный раствор Рингера с 1 мМ EGTA (обозначается «-Ca ²⁺ ») в течение 10 минут при 37 ° C, а затем фиксируют в течение 25 минут 4% формальдегидом. После фиксации клетки ненадолго промывали PBS и помещали в Mowiol.

Микроскопия

отображали на инвертированном микроскопе Leica DMIRE2, оборудованном конфокальным сканером TCS SP2 (AOBS) и 63x NA1.4 Объектив HCX PL Apo (Leica). Перенос энергии резонанса флуоресценции (FRET) измеряли с помощью Acceptor Photobleaching [21]. Церулеан и YFP возбуждались с использованием линий 458 и 514 нм аргонового лазера соответственно. Эмиссию церулеана регистрировали в спектральном окне 470–505 нм, а YFP — 525–610 нм. Использование 458 нм для возбуждения Cerulean позволяет избежать эффектов фотопревращения YFP [22]. Для измерения эффективности FRET изображения донора (Cerulean) и акцептора (YFP) были получены до и после фото-разрушения YFP до 15% от его начальной интенсивности в выбранной области, представляющей интерес.Размер изображения составлял 1024 × 1024 пикселей, и каждая строка была усреднена по двум последовательным линейным сканированием. Небеленые области использовались в качестве контроля движения образца или колебаний мощности лазера. Пиксели из этих областей были включены в наш анализ (обозначены как «Контрольные») в качестве базового ориентира. Значения усиления и смещения фотоумножителя, а также интенсивности лазера были установлены так, чтобы максимизировать линейность, и оставались постоянными для изображений, полученных до и после обесцвечивания акцепторного флуорофора. Отверстие крошечного отверстия было максимально открыто во время сбора данных (5.2 единицы Эйри).

Анализ изображений и количественная оценка

Анализ изображений был выполнен с помощью пакета Matlab 7.0 (The Mathworks) с использованием специально написанных скриптов. Вкратце, изображения доноров были объединены (2 × 2) и впоследствии подвергнуты низкочастотному фильтру Винера и Гауссу с размерами ядра 3 × 3. Из изображений вычитали фон и устанавливали пороговые значения интенсивности флуоресценции. Эффективность FRET (E) рассчитывалась на попиксельной основе путем определения разницы между интенсивностями донора до (Dpre) и после фотообесцвечивания (Dpost) акцептора и нормализации к интенсивности донора после фотообесцвечивания (E = 1- (Dpre / Dpost)).Эффективность FRET представлена ​​псевдо-цветом для лучшей визуализации. Кумулятивные гистограммы распределения эффективности FRET для каждого экспериментального условия были получены путем нормализации совокупной эффективности FRET на пиксель нескольких ячеек на количество пикселей, проанализированных в интересующих областях (или неотбеленных контрольных областях), и на количество ячеек для каждого условия. Эти распределения представляют собой функции плотности вероятности (PDF) с интегралом, равным единице. Статистический анализ проводился с использованием t-критерия Стьюдента.

Тесты наложения

Экспрессия N-конца GST-rEAG1 была индуцирована в BL21 (DE3) E. Coli (Stratagene) с помощью 1 мМ IPTG. Клетки собирали через 4 часа, лизировали короткой обработкой ультразвуком и кипятили в течение 5 минут в загрузочном буфере Лэммли. Белки разделяли с помощью SDS-PAGE и либо окрашивали бриллиантовым красителем Кумасси, либо переносили на нитроцеллюлозные мембраны (GE Healthcare). Мембраны блокировали в течение ночи при 4 ° C 5% (мас. / Об.) Сухим молоком в TBS-T (200 мМ трис-HCl, pH 7.4, 140 мМ NaCl, 0,1% Твин-20) с последующей 2-часовой инкубацией при комнатной температуре с 0,5 мкг / мл биотинилированного СаМ (Calbiochem) и 1 мМ CaCl ₂ в TBS-T, промывали один раз в течение 10 мин в 0,5 % Triton TX-100, 1 мМ CaCl ₂ в TBS-T и дважды в течение 10 мин в 1 мМ CaCl ₂ в TBS-T. Затем мембраны инкубировали в течение 1 часа с 0,2 мкг / мл HRP-конъюгированного стрептавидина (Pierce) в TBS-T с 1 мМ CaCl ₂ , промывали четыре раза в течение 5 минут в том же буфере и детектировали с помощью набора Enhanced Chemo-Luminescence. (ECL, GE Healthcare).

Результаты

Клеточный FRET-анализ на Ca

Чтобы установить FRET-анализ для Ca ²⁺ / CaM-опосредованной регуляции hEAG1 в клетках млекопитающих, субъединицы канала были слиты на их С-конце либо с Cerulean, либо с YFP. Мечение C-конца субъединиц канала флуоресцентными белками (FP) не влияет на внутриклеточную локализацию и функциональность канала.Когда hEAG1 был слит на С-конце с FP и экспрессировался в нескольких линиях клеток млекопитающих, его флуоресцентный сигнал локализовался в основном в небольших пузырьках в цитоплазме и в эндоплазматическом ретикулуме, а также в соединительной ядерной оболочке (Рис. 1A). Иногда окрашивание плазматической мембраны можно было различить как слабую контурную линию. Этот паттерн экспрессии был таким же, как и паттерн экспрессии немеченых сверхэкспрессированных каналов, обнаруженный моноклональными антителами, распознающими внутриклеточную часть канала.Токи и кинетика слитого с GFP hEAG1 были, кроме того, неотличимы от таковых немеченых каналов (данные не показаны).

Рисунок 1. Визуализация Ca ²⁺ -зависимого взаимодействия hEAG1-Cerulean с CaM в клетках с помощью FRET.

Интенсивность флуоресценции и эффективность FRET (E%) изображений HEK-293, трансфицированных (A) С-концом hEAG1 или (B) полноразмерным hEAG1, меченным Cerulean (донор) и CaM или apoCaM, меченным YFP ( акцептор). Клетки стимулировали 1 мкМ иономицином в присутствии 1.8 мМ Ca ²⁺ (+ Ca ²⁺ ) или 1 мМ EGTA (-Ca ²⁺ ) в течение 10 мин. FRET измеряли по фотообесцвечиванию акцептора. Белые участки обозначены белыми рамками. Эффективность FRET показана псевдоцветом. Масштабные линейки: 5 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010873.g001

Чтобы охарактеризовать взаимодействие EAG1 с CaM посредством FRET, усеченный цитозольный C-конец (AA 478–962) первоначально коэкспрессировался с YFP-CaM в клетках HEK.С-конец канала равномерно локализовался в цитоплазме и отсутствовал в ядре, тогда как СаМ присутствовал в обоих этих клеточных компартментах. Эксперименты по оптимизации показали, что FRET между hEAG1 и CaM может быть измерен только тогда, когда единицы канала были помечены на их C-концах донорным флуорофором Cerulean и CaM с акцептором YFP на его N-конце, а не наоборот (данные не показаны ). Измерения FRET с помощью метода фотообесцвечивания акцептора требуют молекулярного избытка акцепторного флуорофора [23], условие, которое, вероятно, не соблюдалось, когда CaM был мечен донором.Когда hEAG1 был помечен церулеаном, эффективность FRET не зависела от отношения интенсивностей флуоресценции церулеана к YFP (см. Файл S1 и рис. S1), что позволяет предположить, что в этих экспериментальных условиях наблюдается избыток акцепторного флуорофора.

Чтобы исследовать Ca ²⁺ -зависимость взаимодействия hEAG1-CaM, клетки помещали в Ca ²⁺ -содержащий (1,8 мМ Ca ²⁺ ) или Ca ²⁺ -свободный раствор Рингера (1 мМ EGTA) и стимулировали 1 мкМ иономицином.Клетки фиксировали и измеряли FRET методом фотообесцвечивания акцепторов (рис. 1). Никаких различий в локализации конструкций не наблюдалось при увеличении или истощении Ca ²⁺ . Измерение FRET показало, что C-конец канала взаимодействует с CaM зависимым от Ca ²⁺ образом (рис. 1 A). Клетки с повышенными концентрациями Ca ²⁺ показали среднюю эффективность FRET 9,5% (± 1,3% SEM, n = 13), тогда как было измерено незначительное FRET (2,2 ± 1,6%, n = 9) в обедненном Ca ²⁺ ячеек (p> 0.05). В совокупных распределениях эффективности FRET для всех ячеек это представлено сдвигом распределения FRET к нулю (рис. 2 B). Это указывает на то, что C-конец hEAG1 связывает CaM только в его связанном с Ca ²⁺ состоянии. Это было подтверждено использованием Ca ²⁺ -нечувствительного CaM, YFP-apoCaM в качестве акцептора. Уровни экспрессии YFP-apoCaM в трансфицированных клетках были аналогичны уровням YFP-CaM (фиг. S2). Распределение эффективности FRET для клеток, котрансфицированных apoCaM, перекрывает распределение эффективности клеток, истощенных по Ca ²⁺ (1.2 ± 1,0%, n = 13) с максимумом около нуля.

Зависимое от Ca ²⁺ взаимодействие с CaM также было обнаружено для полноразмерного канала hEAG1 (рис. 1). Канал показал высокую эффективность FRET с YFP-CaM (17,0 ± 2,8%, n = 11) в присутствии Ca ²⁺ . В клетках, истощенных по Ca ²⁺ , были получены значительно сниженные эффективности FRET (10,1 ± 2,5%, n = 11, p <0,05). При котрансфекции с YFP-apoCaM эффективность FRET еще больше снижалась (4,0 ± 2,3%, n = 11), даже в присутствии Ca ²⁺ .Возникновение обнаруживаемого FRET даже после истощения Ca ²⁺ предполагает наличие минимальных количеств связанных с Ca ²⁺ молекул CaM, которые опосредуют связывание с полноразмерным каналом. Более того, это указывает на то, что полноразмерный канал hEAG1 имеет более высокое сродство к Ca ²⁺ / CaM, чем только усеченный С-конец.

Мутация BD-C2 (F714S, F717S) предотвращает связывание CaM с C-концом, но не с полноразмерным каналом hEAG1

Для дальнейшего изучения связывания CaM с C-концом hEAG1 мы ввели мутации F714S, F717S в BD-C2 в усеченный C-конец и полноразмерную конструкцию, соответственно.Характер экспрессии мутированных конструкций не изменился по сравнению с их аналогами дикого типа. Мутация BD-C2 полностью ингибировала взаимодействие CaM с C-концом hEAG1, поскольку FRET не измерялся (p> 0,05) как при высоком (3,2 ± 1,5%, n = 12), так и при низком Ca ²⁺ условиях (1,4 ± 1,5%, n = 11), а также с apoCaM (0,2 ± 1,7%, n = 10) (рис.2).

Рисунок 2. Мутация BD-C2 (F714S, F717S) нарушает связывание CaM с усеченным C-концом hEAG1, но не со всем каналом.

Эффективность FRET меченного церулеаном С-конца и полноразмерного канала wt-hEAG1 при взаимодействии с YFP-CaM в HEK-293 определялась путем фотообесцвечивания акцептора и сравнивалась с эффективностью hEAG1 с мутантным BD-C2 (F714S, F717S ) (A) Средняя эффективность FRET (± SEM) и (B) Кумулятивные гистограммы распределения FRET (функция плотности вероятности, PDF) для нескольких ячеек, как определено в условиях богатого и обедненного Ca ²⁺ .

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0010873.g002

Однако полноразмерный канал, содержащий эти мутации, также взаимодействовал с YFP-CaM в присутствии Ca ²⁺ (8,7 ± 2,2%, n = 11). как при истощении Ca ²⁺ (11,5 ± 2,4%, n = 10). Эффективность FRET клеток с и без Ca ²⁺ существенно не различалась. Кроме того, FRET между конструкциями мутантного канала BD-C2 и YFP-apoCaM был незначительным (2,6 ± 2,2%, n = 9), подтверждая, что взаимодействие не связано со связыванием Ca ²⁺ -несвязанного CaM.Эти результаты показывают, что ранее описанные мутации в BD-C2 (F714S, F717S) полностью предотвращают связывание CaM с усеченным цитозольным C-концом hEAG1 и что одного интактного BD-C1 недостаточно для связывания CaM. Однако мутировавший полноразмерный белок все еще способен связывать CaM либо через BD-N, либо через комбинацию BD-N и BD-C1.

Мутации F151S, A152S предотвращают связывание CaM с N-концом EAG1

При более тщательном изучении последовательности N-конца, два соседних предполагаемых Ca ²⁺ -зависимых CaM-связывающих мотива типа «1-8-14» [24] были обнаружены в AA 151–164 и 165– 178 (рис.3 А). Обе последовательности расположены на участке, который, как предполагается, является амфипатическим и состоит в основном из основных и гидрофобных остатков. Второй предполагаемый связывающий мотив содержит пролин, аминокислоту, которая редко появляется в амфипатических спиралях, хотя это не означает, что этот сайт не может участвовать в связывании СаМ.

Рисунок 3. Мутация как BD-N, так и BD-C2 полностью нарушает связывание CaM с полноразмерным hEAG1.

(A) Аминокислотная последовательность AA 147-209 EAG1 с выделенными двумя предполагаемыми связывающими мотивами 1-8-14 CaM.(B) CaM перекрывающийся блот 1-8-14 мутантного N-конца rEAG1. Обнаружение с помощью стрептавидина, конъюгированного с HRP, показало, что мутации F151S, A152S (I) полностью нарушают связывание биотинилированного CaM, тогда как V164S, L165S (II) и V178S, h279D (III) вызывают только снижение связывания. (C – E) Измерения FRET в клетках, трансфицированных YFP-CaM и меченным Cerulean полноразмерным hEAG1, мутировавшими в BD-N (F151S, A152S) или в обоих BD-N и BD-C2 (F151S, A152S, F714S, F717S). Клетки обрабатывали 1 мкМ иономицином в присутствии высокого Ca ²⁺ .(C) Изображения интенсивности флуоресценции Cerulean-hEAG и YFP-CaM после фотообесцвечивания и соответствующие изображения эффективности FRET в псевдоцвете (D) Кумулятивные гистограммы распределения FRET (функция плотности вероятности, PDF) и (E) средняя эффективность FRET (± SEM ) нескольких ячеек. Шкала шкалы: 5 мкм.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010873.g003

Мутации, затрагивающие оба мотива 1-8-14, были введены в GST-слияние N-концевого сегмента AA 147-209 rEAG1, чтобы локализовать остатки, необходимые для взаимодействия с CaM, и определить, являются ли оба мотива полностью функциональными.Сайты связывания СаМ типа 1-8-14 особенно чувствительны к мутациям в первом (положение 1) и последнем (положение 14) гидрофобных остатках [24]. Были вставлены три пары мутаций. Мутации F151S и A152S были направлены на нарушение гидрофобной области в начале первого мотива 1-8-14 (AA 151–165). Они должны влиять только на этот первый мотив и, следовательно, предоставлять информацию о том, действительно ли оба или только первый из предполагаемых мотивов активно связываются с CaM. Средние мутации, V164S и L165S, были введены с целью разрушения обоих соседних мотивов 1-8-14 в одной конструкции.Третья пара мутаций — V178S, h279D — нацелена на последний гидрофобный остаток второго предполагаемого сайта связывания 1-8-14 (AA 165–178).

Три полученные таким образом конструкции экспрессировали в бактериях и тестировали биохимически на связывание CaM с помощью оверлей-блоттинга (фиг. 3 B). Мутанты V164S, L165S и V178S, h279D, включающие второй мотив 1-8-14, демонстрируют пониженное связывание с биотинилированным CaM по сравнению с GST-N-концом дикого типа. Однако только пара мутаций F151S, A152S на начало первого мотива 1-8-14, привело к полному нарушению связывания.Эти результаты показывают, что первый связывающий мотив 1-8-14 является доминантным СаМ-связывающим доменом в N-концевом цитозольном сегменте EAG1.

каналов hEAG1 с нарушенным BD-N, BD-C2 и интактным BD-C1 неспособны связывать CaM

Чтобы исследовать влияние BD-N на связывание CaM, мутации F151S, A152S были введены как в hEAG1 дикого типа, так и в BD-C2-мутантный hEAG1, и FRET измеряли с помощью фотообесцвечивания акцептора в клетках HEK293 (фиг. 3 C).

Слитые конструкции полноразмерного hEAG1, содержащие только мутации BD-N F151S и A152S, взаимодействовали с YFP-CaM (9.8 ± 2,2%, n = 10) в присутствии Ca ²⁺ . Однако было обнаружено, что конструкции, содержащие как мутированный BD-N, так и BD-C2, не взаимодействуют с YFP-CaM, поскольку не удалось измерить заметный FRET (2,9 ± 2,2%, n = 10). Комбинированных четырех мутаций F151S, A152S, F714S, F717S, таким образом, достаточно, чтобы препятствовать связыванию CaM с hEAG1 (p> 0,05) BD-C1, и другие вспомогательные сайты все еще могут участвовать в механизме связывания кооперативным образом. Мы пришли к выводу, что эти два сайта связывания CaM, высокоаффинный связывающий домен CaM 1-8-14 на N-конце и ранее описанный C-концевой домен связывания на AA 707-276, являются основными сайтами связывания, участвующими в связывании CaM. в EAG1.

Обсуждение

каналов hEAG1 ингибируются Ca ²⁺ / CaM [1], [17], [18]. На основе пептидного скрининга было обнаружено три сайта связывания CaM, один на N-конце (BD-N) и два на C-конце (BD-C1 и BD-C1). Хотя мутации во всех трех доменах, как было показано, снижают ингибирование токов hEAG1 с помощью Ca ²⁺ , участие трех сайтов в прямом связывании CaM с нативным каналом остается неясным. Здесь мы описываем использование анализа на основе FRET для характеристики связывания CaM с потенциал-зависимыми калиевыми каналами hEAG1 в клетках млекопитающих.Используя наш анализ на основе FRET, мы смогли показать, что мутации в СаМ-связывающих доменах BD-N и BD-C2 были достаточными для полного прекращения СаМ-связывания. Это означает, что BD-C1 не может связывать CaM сам по себе и, следовательно, эти два сайта связывания являются двумя основными сайтами, участвующими в прямом связывании CaM с нативными каналами hEAG1.

Относительное сродство отдельных сайтов связывания CaM и их вклад в связывание CaM с нативным каналом EAG1 не были полностью ясны из предыдущих исследований in vitro [18].Аффинность связывания Ca ²⁺ / CaM с BD-N в исследованиях FCS и поверхностного плазмонного резонанса (SPR) зависела от длины используемых пептидов. Было обнаружено, что BD-N имеет примерно такое же сродство к связыванию с Ca ²⁺ / CaM, что и BD-C2, при использовании сегментов GST-слитого белка. Однако, когда анализ FCS был повторен с пептидами, кодирующими минимальные CaM-BD, было обнаружено, что BD-N имеет более высокую аффинность, чем аффинность С-конца (K _D = 45 и 223 нМ, соответственно).Наши данные явно говорят в пользу последней ситуации: было обнаружено, что канал с интактным BD-N взаимодействует с CaM даже в клетках, истощенных по Ca ²⁺ , тогда как C-конец не связывал CaM в тех же условиях. . Это различие, вероятно, отражает более высокое сродство к Ca ²⁺ / CaM BD-N. Обычно известно, что мотивы связывания CaM на основе 1-8-14, присутствующие в BD-N, обладают очень высокой аффинностью связывания с Ca ²⁺ -связанным CaM [24].

Результаты пептидного скрининга также не позволили сделать вывод о сродстве связывания с СаМ BD-C1.Низкое сродство (Kd> 5 мкМ) было обнаружено при использовании GST-слитых сегментов, что означает, что этот сайт не может независимо связывать CaM. С другой стороны, аффинность связывания была выше (K _D = 327 нМ) при использовании флуоресцентно меченных пептидов (~ 20 AA). Наши исследования показывают, что разрушения BD-N и BD-C2 достаточно, чтобы препятствовать связыванию CaM с полноразмерным hEAG1, хотя мы также не можем исключить возможность того, что BD-C1 участвует в связывании CaM кооперативным образом.

Механизм ингибирования CaM EAG, по-видимому, существенно отличается от механизма калиевых каналов, активированных Ca ²⁺ , которые, как было показано, конститутивно связывают CaM независимо от концентрации Ca ²⁺ (см. [25], [26] ] для обзора).Однако было обнаружено, что два семейства каналов со структурным и функциональным сходством с EAG также содержат CaM-связывающие домены, а именно Cyclic Nucleotide Gated (CNG) [27], [28], [29] и каналы KCNQ [30], [31]. Каналы KCNQ конститутивно связывают CaM через IQ-подобный мотив связывания CaM [24], CaM, связанный с каналом таким образом, опосредует ингибирование каналов Ca ²⁺ . Механизм регуляции Ca ²⁺ / CaM каналов KCNQ, следовательно, отличается от механизма каналов EAG, несмотря на их структурное и электрофизиологическое сходство.Каналы CNG являются ближайшими структурными родственниками семейства каналов EAG. Они разделяют некоторые структурные особенности с EAG, включая gating домен циклических нуклеотидов, который, хотя и частично консервативен с точки зрения последовательности, не является функциональным в EAG1 [13], [14]. Механизм модуляции CaM / Ca ²⁺ каналов CNG сложен и зависит от их состава. Обонятельные каналы CNG ингибируются в основном конститутивно связанным CaM через IQ-подобные домены, присутствующие в субъединицах CNGA4 и CNGB1b [27], [32], тогда как стержневые каналы CNG, возможно, ингибируются за счет связывания Ca ²⁺ -ассоциированного CaM [ 27], [29].IQ-подобный CaM-связывающий домен на N-конце субъединицы CNGB1a, по-видимому, опосредует межсубъединичное взаимодействие с C-концом субъединицы CNGA1. Ca ²⁺ / CaM, по-видимому, нарушает это, тем самым ингибируя канал [29]. Мы исследовали, присутствует ли подобный механизм ингибирования в EAG1, однако связывание N- и C-конца не было обнаружено на оверлей-блоте как в присутствии, так и в отсутствие Ca ²⁺ / CaM (данные не показаны). В другом подходе мы сконструировали внутримолекулярный датчик FRET, в котором полноразмерный EAG1 был помечен донорными и акцепторными флуорофорами на его цитозольных концах.Однако нам не удалось измерить различия в эффективности FRET при различных концентрациях Ca ²⁺ (данные не показаны).

Таким образом, результаты, полученные с помощью нашего анализа FRET, подтверждают предыдущую модель взаимодействий hEAG1-CaM и соответствуют идее о том, что в естественных условиях разрушения BD-N и BD-C2 достаточно, чтобы нарушить связывание CaM с канал hEAG1.

Вспомогательная информация

Рисунок S1.

На эффективность hEAG1-CaM FRET не влияет интенсивность флуоресценции.Зависимость эффективности FRET от отношения интенсивности флуоресценции Cerulean / YFP (верхние панели) и интенсивности YFP (нижние панели) для репрезентативных экспериментов с полноразмерным hEAG1 (A – C) и усеченным C-концом (D – F). Поскольку усиление ФЭУ было оптимизировано для каждой из отображаемых ячеек, значения интенсивности 8-битных пикселей были разделены на напряжения ФЭУ, чтобы определить скорректированную интенсивность флуоресценции, которую можно напрямую сравнивать между ячейками. Сплошные линии представляют подгонки данных линейной регрессией, а пунктирные линии представляют доверительный интервал наиболее подходящей линии.На каждом графике указана степень соответствия (r ² ). Ни одна из наиболее подходящих линий не имела крутизны, существенно отличавшейся от нуля (F-тест с нулевой наклонной линией в качестве нулевой гипотезы), что указывает на то, что в используемых экспериментальных условиях и для диапазона концентраций флуорофора, присутствующего в образцах, FRET эффективность не зависит от интенсивности флуоресценции донорных и акцепторных флуорофоров.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010873.s001

(0.85 МБ PDF)

Рисунок S2.

Уровни экспрессии YFP-CaM и YFP-apoCaM схожи, что определяется по уровням интенсивности флуоресценции. Средняя интенсивность флуоресценции клеток, экспрессирующих YFP-CaM или YFP-apoCaM, в двух репрезентативных экспериментах, в которых обе конструкции котрансфицировали С-термом, меченным Cerulean. hEAG1 (A) или C-термин hEAG1 с мутациями BD-C2 (B). Поскольку усиление ФЭУ было оптимизировано для каждой из отображаемых ячеек, значения интенсивности 8-битных пикселей были разделены на напряжения ФЭУ, чтобы определить скорректированную интенсивность флуоресценции, которую можно напрямую сравнивать между ячейками.Мощность лазера поддерживалась постоянной для каждого эксперимента. В эксперименте A уровни интенсивности CaM были немного выше, чем apoCaM (0,48 ± 0,02 и 0,34 ± 0,02, соответственно, p <0,05), однако в эксперименте B уровни интенсивности обеих конструкций были одинаковыми.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0010873.s002

(0,18 МБ PDF)

Благодарности

Мы благодарим Гертруду Бунт за ее неоценимую помощь в разработке, проведении и анализе экспериментов FRET, а также за ее критические обсуждения.Авторы также благодарят Еву Эрреро-Эрранц и Милену Нинкович за помощь с клонированием, Антона Карабиноса за его поддержку с наложением блоттинга, Франсиско Монье за ​​электрофизиологию, Алессандро Эспозито за его поддержку с анализом и сценариями.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: JTG WS. Провел эксперименты: JTG. Проанализированы данные: JTG. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: WS. Написал статью: JTG WS.

Ссылки

1. 1.Stansfeld CE, Roeper J, Ludwig J, Weseloh RM, Marsh SJ, et al. (1996) Повышение уровня внутриклеточного кальция за счет активации мускариновых рецепторов вызывает блокировку активируемых напряжением каналов эфирного эфира крысы в ​​стабильно трансфицированной клеточной линии. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 9910–9914.
2. 2. Meyer R, Schonherr R, Gavrilova-Ruch O, Wohlrab W, Heinemann SH (1999) Идентификация эфирных и кальциевых калиевых каналов в клетках меланомы человека. J Membr Biol 171: 107–115.
3. 3. Пардо Л.А., дель Камино Д., Санчес А., Алвес Ф., Брюггеманн А. и др. (1999) Онкогенный потенциал K (+) каналов ЕАГ. EMBO J 18: 5540–5547.
4. 4. Окчиодоро Т., Бернхейм Л., Лю Дж. Х., Биджленга П., Синнрайх М. и др. (1998) Клонирование калиевого канала простого эфира человека, экспрессируемого в миобластах в начале слияния. FEBS Lett 434: 177–182.
5. 5. Brueggemann A, Pardo LA, Stuehmer W, Pongs O (1993) Ether-à-go-go кодирует управляемый по напряжению канал, проницаемый для K + и Ca2 + и модулируемый cAMP.Природа 365: 445–448.
6. 6. Ganetzky B, Wu CF (1983) Нейрогенетический анализ калиевых токов у Drosophila: синергетические эффекты на нервно-мышечную передачу у двойных мутантов. Журнал Neurogenet 1: 17–28.
7. 7. Каплан В.Д., Траут В.Е. (1969) Поведение четырех неврологических мутантов дрозофилы. Генетика 61: 399–409.
8. 8. Warmke JW, Ganetzky B (1994) Семейство генов калиевых каналов, связанных с eag у дрозофилы и млекопитающих.Proc Natl Acad Sci U S A 91: 3438–3442.
9. 9. Кабрал Дж. Х. М., Ли А., Коэн С. Л., Чайт Б. Т., Ли М. и др. (1998) Кристаллическая структура и функциональный анализ N-конца калиевого канала HERG: эукариотический домен PAS. Ячейка 95: 649–655.
10. 10. Schoenherr R, Gessner G, Loeber K, Heinemann SH (2002) Функциональное различие калиевых каналов EAG1 и EAG2 человека. FEBS Lett 514: 204–208.
11. 11. Warmke J, Drysdale R, Ganetzky B (1991) Отдельный полипептид калиевого канала, кодируемый локусом eag Drosophila.Science 252: 1560–1562.
12. 12. Terlau H, Heinemann SH, Stuehmer W, Pongs O, Ludwig J (1997) Амино-терминальное закрытие крысиного канала калиевого канала компенсируется мутацией в сегменте S4. J Physiol 502 (Pt 3): 537–543.
13. 13. Робертсон Г.А., Вармке Дж. М., Ганецки Б. (1996) Калиевые токи, экспрессируемые из кДНК eag дрозофилы и мыши в ооцитах Xenopus. Нейрофармакология 35: 841–850.
14. 14. Брелидзе Т.И., Карлсон А.Е., Заготта В.Н. (2009) Отсутствие прямой циклической нуклеотидной модуляции каналов mEAG1 и hERG1, выявленное флуоресцентными и электрофизиологическими методами.J Biol Chem 284: 27989–27997.
15. 15. Jenke M, Sánchez A, Monje F, Stuehmer W., Weseloh RM и др. (2003) С-концевые домены, участвующие в функциональной поверхностной экспрессии калиевых каналов. EMBO J 22: 395–403.
16. 16. Ludwig J, Owen D, Pongs O (1997) Карбоксиконцевой домен опосредует сборку потенциалзависимого крысиного эфир-à-go-go калиевого канала. EMBO J 16: 6337–6345.
17. 17. Schoenherr R, Loeber K, Heinemann SH (2000) Ингибирование калиевых каналов эфирного эфира человека с помощью Ca (2 +) / кальмодулина.EMBO J 19: 3263–3271.
18. 18. Цихнер У., Шёнхерр Р., Борн А.К., Гаврилова-Рух О., Глейзер Р.В. и др. (2006) Ингибирование калиевых каналов человеческого эфира путем связывания Са / кальмодулина с цитозольными N- и С-концами. FEBS J 273: 1074–1086.
19. 19. Моро В., Фришкнехт Ф., Рекманн И., Винсентелли Р., Рабут Г. и др. (2000) Комплекс N-WASP и WIP объединяет сигнальные каскады, которые приводят к полимеризации актина. Nat Cell Biol 2: 441–448.
20. 20.Mori MX, Erickson MG, Yue DT (2004) Функциональная стехиометрия и локальное обогащение кальмодулина, взаимодействующего с каналами Ca2 +. Наука 304: 432–435.
21. 21. Bastiaens PI, Majoul IV, Verveer PJ, Soeling HD, Jovin TM (1996) Визуализация внутриклеточного движения и состояния четвертичной структуры AB5 токсина холеры. EMBO J 15: 4246–4253.
22. 22. Валентин Г., Верхегген С., Пиолот Т., Нил Н., Коппи-Мойзан М. и др. (2005) Фотопреобразование YFP ​​в CFP-подобные частицы во время экспериментов FRET по фотообесцвечиванию акцепторов.Нат методы 2: 801.
23. 23. Takanishi CL, Bykova EA, Cheng W, Zheng J (2006) Анализ FRET на основе GFP в живых клетках. Brain Res 1091: 132–139.
24. 24. Rhoads AR, Friedberg F (1997) Мотивы последовательности для распознавания кальмодулина. FASEB J 11: 331–340.
25. 25. Stocker M (2004) Ca (2 +) — активированные K + каналы: молекулярные детерминанты и функция семейства SK. Nat Rev Neurosci 5: 758–770.
26. 26. Сайми Й., Кунг С. (2002) Кальмодулин как субъединица ионного канала.Анну Рев Физиол 64: 289–311.
27. 27. Grunwald ME, Yu WP, Yu HH, Yau KW (1998) Идентификация домена на бета-субъединице катионного канала стержня, управляемого cGMP, который опосредует ингибирование кальций-кальмодулином. J Biol Chem 273: 9148–9157.
28. 28. Weitz D, Zoche M, Mueller F, Beyermann M, Koerschen HG и др. (1998) Кальмодулин контролирует канал CNG фоторецептора палочки через нетрадиционный сайт связывания на N-конце бета-субъединицы. EMBO J 17: 2273–2284.
29. 29. Trudeau MC, Zagotta WN (2002) Механизм ингибирования кальцием / кальмодулином стержневых циклических нуклеотидно-управляемых каналов. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 8424–8429.
30. 30. Wen H, Levitan IB (2002) Кальмодулин является вспомогательной субъединицей калиевых каналов KCNQ2 / 3. J Neurosci 22: 7991–8001.
31. 31. Yus-Najera E, Santana-Castro I, Villarroel A (2002) Идентификация и характеристика непостоянного сайта связывания кальмодулина в неинактивирующих потенциал-зависимых калиевых каналах KCNQ.J Biol Chem 277: 28545–28553.
32. 32. Bradley J, Bonigk W, Yau KW, Frings S (2004) Кальмодулин постоянно связывается с обонятельными каналами CNG крысы в ​​естественных условиях. Nat Neurosci 7: 705–710.

FRET выявляют несколько субъединиц CNGB1, когда CNGA1 CLZ …

Контекст 1

… 7. Ранее было показано, что если субъединицы CNGA1 сливаются с eCFP и eYFP (индивидуально) и коэкспрессируются с субъединицами CNGB1 в ооцитах Xenopus, то имеется значительный FRET для каналов в плазматической мембране 7.Однако, если субъединицы CNGB1 были слиты с eCFP и eYFP и коэкспрессированы с субъединицами CNGA1, FRET практически отсутствовал (рис. 4a). Эти результаты показали, что гетеромерные стержневые каналы CNG в плазматической мембране содержат несколько субъединиц CNGA1, но только одну субъединицу CNGB1 (3: 1 …

Контекст 2

… Домен CLZ позволил включить несколько субъединиц CNGB1 в гетеромерные каналы. Если в гетеромерных каналах имеется несколько субъединиц CNGB1, то мы должны наблюдать FRET между субъединицами CNGB1 при слиянии с eCFP и eYFP и коэкспрессии с субъединицами CNGA1-∆CLZ (рис. ….

Контекст 3

… результаты коэкспрессии CNGA1-∆CLZ с eCFP-CNGB1-∆N и eYFP-CNGB1-∆N показаны на рисунке 4b. FRET измеряли по сенсибилизированному испусканию акцептора с использованием спектров флуоресценции 23. …

Контекст 4

… компонент (оранжевая кривая) был извлечен путем вычитания масштабированного спектра излучения только из eCFP (синяя кривая). Этот выделенный спектр содержит излучение eYFP как от FRET, так и от прямого возбуждения eYFP светом 458 нм.Чтобы выделить компонент, обусловленный FRET, фракционное возбуждение eYFP светом 458 нм относительно света 488 нм (отношение Ao) (рис. 4c, методы) вычитали из соответствующего фракционного возбуждения для каналов, содержащих eCFP и eYFP (отношение A ). Соотношение A-Ratio Ao прямо пропорционально эффективности FRET 23. Как показано на рисунке 4d, отношение A-Ratio Ao было значительно больше с CNGA1-∆CLZ, чем с CNGA1, когда субъединица CNGA1 была совместно экспрессирована с флуоресцентным …

Контекст 5

… A-Ratio Ao прямо пропорционально эффективности FRET 23. Как показано на фиг. 4d, соотношение A-Ratio Ao было значительно больше с CNGA1-∆CLZ, чем с CNGA1, когда субъединица CNGA1 коэкспрессировалась с флуоресцентным CNGB1. Эти результаты напрямую демонстрируют, что удаление домена CLZ вызывает сборку множества субъединиц CNGB1. …

Context 6

… с субъединицей CNGB и акцепторный флуорофор (eYFP) был слит с субъединицей CNGA, тогда увеличение очевидного FRET должно наблюдаться, если несколько субъединиц CNGB1 собраны в канале com — плекс (дополнительный рис.S2). Действительно, результаты показывают значительное увеличение FRET между eCFP-CNGB1-∆N и eYFP-CNGA1-∆CLZ по сравнению с eYFP-CNGA1 (рис. 4e). Эти результаты показывают, что множественные субъединицы CNGB1 собираются совместно с субъединицами CNGA1- ∆CLZ. В целом очевидно, что удаление домена CLZ ослабляет ограничение 3: 1 на субъединицу …

Контекст 7

… структуры как CNGA1 # 621-690, так и CNGA3 # 626-672 состояли из длинных (65 Å) параллельные трехспиральные домены coiled-coil (рис.6). Последовательность за пределами домена CLZ в CNGA1 (аминокислоты 665-675 для цепи A; 665-676 для цепи B; и 665-670 для цепи C) расширяется наружу и частично участвует во взаимодействиях упаковки кристаллов (дополнительный рис. S4). Кроме того, структура CNGA1 # 621-690 содержала два связанных тяжелых атома на тример с электронной плотностью более 10 сигма (рис. 6; дополнительный рис. S5). …

ВОРОТА АКТИВАЦИИ КАНАЛОВ, ЗАЩИЩЕННЫХ ЦИКЛИЧЕСКИМИ НУКЛЕОТИДАМИ — UC Davis

ОПИСАНИЕ (предоставлено заявителем): Циклические нуклеотидно-управляемые (CNG) каналы играют фундаментальную роль в фоторецепторных нейронах, где они опосредуют заключительный этап сигнала. каскад трансдукции запускается поглощением фотонов.Это проницаемые для Са2 + неселективные катионные каналы, которые открываются связыванием циклических нуклеотидов. Мутации в генах каналов CNG ответственны за многочисленные заболевания зрительной системы, включая пигментный ретинит (дегенерация сетчатки) и ахроматопсия (полная дальтонизм). Каналы CNG являются членами большого семейства ионных каналов, содержащих P-петлю, которые имеют значительные общие структурные и функциональные сходства. Долгосрочная цель предлагаемых экспериментов — понять, как конформационные перестройки в канальном белке приводят к открытию поры канала CNG.В то время как недавние кристаллические структуры бактериальных каналов, содержащих P-петлю, выявили конформации как закрытых, так и открытых пор, многие фундаментальные вопросы, касающиеся молекулярного механизма стробирования каналов, остаются без ответа. Какая структура пор составляет ворота активации? Какие структурные движения инициируют проникновение ионов? Для решения этих и связанных с ними вопросов в каналах CNG грант будет использовать особое преимущество нашей недавно разработанной флуоресцентной техники (называемой Patch-Clamp Fluorometry или PCF), которая основана на сайт-специфической флуоресцентной маркировке каналов в изолированных участках мембраны.PCF будет использоваться для одновременной регистрации сигналов флуоресценции и тока от одной и той же популяции каналов в реальном времени и для прямой корреляции структурных изменений в белке канала с их эффектами стробирования. PCF будет сочетаться с гашением флуоресценции и резонансным переносом энергии флуоресценции (FRET) для исследования структуры пор канала, а также перестроек в структуре во время активации канала CNG. Результаты этих экспериментов улучшат наше понимание молекулярных основ стробирования каналов КПГ как при физиологических, так и при болезненных состояниях.

% PDF-1.4 % 165 0 объект >>> эндобдж 252 0 объект > / Шрифт >>> / Поля [] >> эндобдж 256 0 объект > поток uuid: 00d4a3c9-1dd2-11b2-0a00-c900a8f18bffadobe: docid: indd: d0f474e7-6728-11e3-855b-9ecab9f60a19adobe: docid: indd: d0f474e7-6728-11e3-8554dfecabecab: 9ecabecabecb6e5ecb-9ecb-9ecb-9ecb-9ecb-9ecb-9ecb-9ecab docid: indd: d0f474e4-6728-11e3-855b-9ecab9f60a19

[^ | nzo ~ x ׏_ oo ~ x0g ?.ÛS> \ NtNKtCeO | eD.ɸ> ỳO

Датчик движения С-конца FRET выявляет активацию VRAC посредством передачи сигналов DAG плазматической мембраны, а не ионной силы

[Примечание редакции: план авторов по исправлениям был одобрен, и авторы подали официальную пересмотренную заявку.]

Учитывая список важных изменений, включая новые эксперименты, редакторы и рецензенты приглашают вас ответить в течение следующих двух недель с планом действий и графиком завершения дополнительной работы.Мы планируем поделиться вашими ответами с рецензентами, а затем выпустить обязательную рекомендацию.

Три рецензента согласны с тем, что основной проблемой в этой статье является отсутствие подтверждения электрофизиологией данных FRET. Очень важно проводить одновременные эксперименты, измеряя FRET и ток в ответ на активирующие стимулы. Если это выходит за рамки ваших технических возможностей, по крайней мере, такие же эксперименты для измерения FRET должны быть повторены электрофизиологами.Также важно, чтобы данные FRET и визуализации были представлены в более четкой форме и чтобы эксперименты PKC FRET также подтверждались электрофизиологией. Более подробный список комментариев см. В отчете рецензентов ниже.

Как мы описываем в приведенном ниже ответе по пунктам, мы стремились решить все эти вопросы. Мы провели флуорометрию патч-зажим для одновременного измерения FRET и токов, продемонстрировав связь изменения сигнала FRET с активацией VRAC.Мы улучшили представление наших данных и экспериментальных методов. Кроме того, мы провели электрофизиологические эксперименты и одновременные измерения FRET / тока, чтобы исследовать механизм активации VRAC. Тем самым мы подтвердили роль диацилглицерина. Вместо PKC мы смогли определить роль PKD в активации VRAC, используя объединенную мощность электрофизиологии и нашего датчика FRET. Кроме того, мы неожиданно обнаружили артефакты, связанные с конфигурацией целых клеток, которые остались бы не обнаруженными без нашего оптического инструмента.

Рецензент № 1:

В этой статье группы Stauber представлены результаты экспериментов, в которых они измерили сигнал FRET между присоединенной парой флуоресцентных белков в белках LRRC8A или E, которые образуют регулируемые по объему каналы VRAC. Измерения показывают, что сигнал FRET модулируется применением гипотонических растворов. Авторы утверждают, что сигнал связан с активацией канала VRAC, и представляют дополнительные экспериментальные доказательства того, что активация также опосредуется активацией фосфорилирования PKC.Экспериментальные методы адекватны, и в целом выводы подтверждаются доказательствами.

Мы благодарим рецензента за эти положительные комментарии.

Есть несколько моментов, которые необходимо изложить более четко. В частности, хотя есть доказательства того, что сигнал FRET специфичен для LRRC8, авторы цитируют несколько обзоров в качестве доказательства того, что сигнал FRET коррелирует с динамикой активации VRAC тем же стимулом. Однако доказательства в этих ссылках показывают, что активация VRAC стимулами фиксации напряжения происходит в мс временной шкале, и не показаны данные о динамике реакции на гипертонический стимул.Авторам необходимо показать параллельный эксперимент, показывающий величину тока VRAC, продуцируемого LRRC8A / A и LRRC8A / E в их конкретной системе экспрессии.

Следуя предложениям рецензентов, мы выполнили флуорометрию с помощью патч-зажима, чтобы одновременно измерить FRET и токи LRRC8A-CFP / E-YFP в клетках HEK293, дефицитных по эндогенному VRAC. Эти измерения продемонстрировали, что временной ход изменений FRET коррелирует с текущей активацией и инактивацией при применении гипотонического буфера и последовательного изотонического буфера (новый рисунок 1F).Это заменяет цитирование обзоров на данной позиции. Пока нам не удалось измерить токи от гомомерных каналов LRRC8A / A — возможно, из-за чрезвычайно низкой проводимости (Gaitán-Peñas et al., 2016; Deneka et al., 2018).

Эксперименты с фиксацией напряжения показывают, что токи VRAC деактивируются в ответ на продолжительный приложенный стимул. Важно обсудить устойчивый характер сигнала FRET, если он связан с активацией канала. Считается ли, что для каждой модальности активации канала существуют разные ворота?

Как также видно из наших одновременных измерений FRET / тока, сигнал FRET (уменьшенный FRET, коррелирующий с активным VRAC) следует за токами (которые мы измеряем при -80 мВ).Устойчивая активность VRAC при гипотоничности не является чем-то необычным как в режиме фиксации напряжения на целых клетках (например, обзор Pederson et al., 2016 и показан на их рисунке 1A), так и в клетках, не подвергнутых фиксации на целых клетках (как видно из многочисленных примеров). эксперименты по изучению VRAC-опосредованного оттока осмолита). Зависящая от времени инактивация нефизиологическими деполяризованными напряжениями типична для токов VRAC (кинетика инактивации и зависимость от напряжения меняются в зависимости от состава субъединицы LRRC8 — Voss et al., 2014, Ullrich et al., 2016). Мы наблюдали инактивацию этой характеристики в наших протокольных измерениях скачка напряжения, которые мы обычно проводили, чтобы подтвердить, что измеряемые нами токи опосредованы VRAC (новый рисунок 1F и новый рисунок 4C). Вероятно, существуют разные ворота для активации / инактивации за счет осмолярности и инактивации, вызванной деполяризацией, но обсуждение этого выходит за рамки данного исследования.

Рецензент № 2:

Для редакторов

Авторы разработали очень интересный анализ для мониторинга активности LRRC8-опосредованных каналов VRAC с использованием чисто оптического анализа на основе FRET.Такой анализ может быть полезен для исследований структуры-функции, а также для изучения функции VRAC в физиологических условиях. Однако основная критика заключается в том, что анализ не был подтвержден параллельными электрофизиологическими измерениями. Если авторы могут предоставить такое подтверждение, я бы поддержал публикацию.

Благодарим рецензента за в целом положительные комментарии. Следуя предложениям рецензентов, мы выполнили серию электрофизиологических измерений, также параллельно с нашим анализом FRET.

Авторам

В рукописи König et al. Описан метод мониторинга активности чувствительных к объему каналов VRAC / LRRC8 с разрешением во времени и пространстве путем измерения внутрикомплексного FRET между слитыми с С-концом флуоресцентными белками. Преследуются две основные цели: во-первых, продемонстрировать гибкость доменов с богатыми лейцином повторами (LRRD) и их участие в закрытии канала; во-вторых, чтобы предоставить доказательства того, что низкая внутриклеточная ионная сила не является физиологически значимым параметром для открытия VRACs.Скорее авторы предполагают, что активация при гипотонической стимуляции связана с активностью PKC.

Кроме того, авт. Используют анализ, чтобы показать, что LRRC8 обеспечиваемый VRAC не активируется в эндомембранах, а только в плазматической мембране.

Ключевые вопросы, лежащие в основе работы, заслуживают похвалы и потенциально очень важны для данной области. В частности, метод введения внутримолекулярного датчика FRET расстояния до субъединиц является весьма инновационным и потенциально очень полезным.Возможность контролировать активность LRRC8 с помощью чисто оптического анализа очень интригует.

Мы благодарим рецензента за эти положительные комментарии. Действительно, теперь мы видим главное преимущество чисто оптического анализа — мы не диализируем клетку и не теряем сигнальные пути.

Однако для полной валидации анализа необходимо несколько технических контролей. Что наиболее важно, обязательно, чтобы сам анализ и другие результаты подтверждались электрофизиологическими данными.

Все эксперименты должны быть дополнены электрофизиологическими записями. В принципе, было бы наиболее убедительно, если бы анализ FRET мог быть выполнен на той же клетке, которая была закреплена заплатой, чтобы убедиться, что изменения FRET отражают текущую активацию. Поскольку это может быть технически слишком сложно, необходимо, по крайней мере, проверить конструкции, используемые при электрофизиологических записях, в тех же условиях, что и анализ FRET. Присоединение флуоресцентных белков к С-концу может изменить «чувствительность к объему» само по себе.Фактически, добавление флуоресцентных белков к С-концу приводит к конститутивной активности анионных каналов в ооцитах Xenopus (Gaitán-Peñas et al., 2016).

Как было предложено авторами обзора, мы выполнили флуорометрию с помощью патч-зажима и измерили FRET и ток в одних и тех же клетках. Мы обнаружили, что (как ранее описано Gaitán-Peñas et al., 2016) меченые конструкции давали остаточные токи в изотоничности. Тем не менее, токи явно усиливались гипотоничностью (как показывают измерения в ооцитах, проведенные Gaitán-Peñas et al., 2016). Это сделало измерения действительно технически сложными (со сверхэкспрессией клеток ниже 20% по сравнению с более чем 50% успешных результатов в клетках дикого типа), как также заявили Gaitán-Peñas et al., 2016: «Однако мы обнаружили это. быть чрезвычайно трудным из-за очень низкой вероятности успеха образования гига-уплотнения. В нескольких успешных записях можно было наблюдать конститутивную VRAC-подобную активность канала (данные не показаны) ». Тем не менее, с помощью флуориметрии патч-кламп мы смогли убедительно подтвердить связь наблюдаемых изменений FRET с активацией VRAC.

Авт. Предполагают центральную роль PKC в закрытии канала и указывают, что его фармакологическое ингибирование предотвращает открытие VRAC, управляемое гипотонией. Опять же, этот результат должен быть подтвержден электрофизиологическими записями с использованием тех же конструкций и конструкций без метки — необходимо количественное сравнение плотности тока с применением и без применения PMA / Gö6983 / стауроспорина.

Мы сначала подтвердили, что PMA также вызывает снижение cFRET в HEK293 в дополнение к клеткам HeLa (новая правая панель на рисунке 4A) и что изменения cFRET были специфичными для VRAC, поскольку неродственный датчик FRET (CFP-18aa-YFP) не действовал. ответить на PMA (новый рисунок 4 — приложение к рисунку 1A).Впоследствии мы провели электрофизиологические эксперименты на клетках, сверхэкспрессирующих наши конструкции LRRC8 с флуоресцентной меткой, и на клетках дикого типа с эндогенным VRAC, чтобы исследовать роль киназ, активированных DAG (и PMA).

Примечательно, и сначала в явном противоречии с нашими результатами измерений FRET, мы обнаружили, что PMA не активировал VRAC в зажатых клетках (новый рисунок 4B). Приложение PMA не повлияло ни на текущую, ни, что удивительно, на cFRET.Однако, когда мы инкубировали клетки с PMA перед установлением конфигурации целых клеток, мы обнаружили активацию флуоресцентно-меченного VRAC и эндогенного VRAC, как показано на новом рисунке 4C. Следовательно, мы могли бы подтвердить наши данные cFRET электрофизиологическими методами и могли бы впервые показать, что цельноклеточная фиксация клеток влияет на передачу сигналов в пути активации VRAC, возможно, посредством клеточного диализа. Электрофизиологические измерения дополнительно подтвердили ингибирующий эффект DOG (ингибитор киназы DAG) на инактивацию VRAC после гипотонии как для флуоресцентно меченных LRRC8, так и для эндогенного VRAC (новый рисунок 5C), подтверждая роль передачи сигналов DAG в активации VRAC.

Наши попытки подтвердить влияние Gö6983 на cFRET электрофизиологическими измерениями привели к парадоксальным результатам. В клетках, содержащихся в цельноклеточной конфигурации патч-зажим, мы наблюдали огромное увеличение cFRET в четыре раза, что мы просто не можем объяснить. Параллельно Gö6983 не подавлял токи VRAC, фактически искажая предполагаемую роль PKC в активации VRAC. В самом деле, мы бы упустили этот момент, если бы не проводили контрольные электрофизиологические эксперименты, предложенные тремя рецензентами.Мы соответствующим образом изменили все соответствующие утверждения в рукописи. Вместо этого применение Gö6983 уменьшило инактивацию токов, когда мы изменили буфер с гипотонического на изотонический. Мы показываем эти данные на новом Рисунке 4 — в приложении 2, но не делаем однозначных выводов.

Исключив PKC как основной медиатор активации VRAC диацилглицерином (или PMA), мы протестировали PKD, которая также может быть привлечена к мембране и активирована DAG (и PMA). В отличие от Gö6983, ингибитор PKD CRT 0066101 уменьшал индуцированные гипотонией токи VRAC как во время зажима, так и при применении до прорыва мембраны (новый рисунок 5A, B).

Рецензент № 3:

Анионные каналы с регулируемым объемом (VRAC) играют центральную роль в модуляции объема клеток у животных, обеспечивая выход ионов хлора и более крупных осмолитов из клетки при активации в гипотонических условиях и, следовательно, противодействуя набуханию клеток. Эти каналы представляют собой гетерогексамеры, состоящие из обязательной субъединицы LRRC8A и дополнительных субъединиц LRRC8-B-E. Механизм активации VRAC не изучен, но было высказано предположение, что он связан с конформационными изменениями на его С-конце, и было показано, что он запускается снижением ионной силы в восстановленной системе.В настоящей рукописи Бенджамин Кениг и его сотрудники конструируют основанный на FRET датчик активности VRAC путем слияния С-концов различных субъединиц с любым из двух флуоресцентных белков, способных к FRET. Авторы показывают изменения FRET в ответ на гипотоническую среду, которые являются обратимыми при возврате к изотоническим условиям, с кинетикой и фармакологией, которые согласуются с сигналом, происходящим от активации VRAC. Они также показывают, что обусловленные гипотоничностью изменения FRET происходят только для каналов в плазматической мембране, тогда как те, которые расположены во внутриклеточных компартментах (ER и golgi), не обнаруживают изменений в FRET.Они демонстрируют, что требование активности локализации в плазматической мембране не связано с различиями в концентрации холестерина или целостностью актинового цитоскелета. Напротив, авторы обнаружили, что стимуляция активности PKC приводит к заметным изменениям FRET, подобным тем, которые производятся гипертонической средой, тогда как ингибирование PKC предотвращает изменения FRET в ответ на гипотоническую среду. Авторы разработали набор умных инструментов для отслеживания активности VRAC, не требуя электрофизиологических измерений, и предоставляют релевантную информацию о физиологических условиях клетки, которые обеспечивают активность VRAC, и о роли С-конца в активации канала.Однако я думаю, что рукопись была бы намного сильнее, если бы авторы предоставили более прямые доказательства того, что изменения FRET действительно связаны с активацией канала. Кроме того, они должны устранить некоторые очевидные несоответствия в своих наблюдениях, а также в отношении опубликованных данных, а также предоставить дополнительную информацию о некоторых экспериментах.

Благодарим рецензента за в целом положительные комментарии. Мы рассмотрели опасения рецензента, как описано ниже.

У меня есть следующие конкретные проблемы:

1) Все выводы в рукописи основаны на предположении, что наблюдаемые изменения FRET отражают активацию канала.Однако доказательства, подтверждающие это, не являются прямыми, а скорее зависят от коррелятивных наблюдений за эффектами неспецифических методов лечения, которые также могут влиять на другие процессы в клетке. Возможно, что изменения FRET отражают конформационное изменение, независимое или, по крайней мере, частично независимое от активации. Этот вопрос особенно важен, учитывая, что роль С-конца в активации не установлена. Я думаю, что рукопись была бы значительно сильнее, если бы авторы могли предоставить более прямые доказательства этого, выполнив электрофизиологические измерения в сочетании с измерениями FRET, или используя дополнительные специфические ингибиторы VRAC, или проведя эксперименты с потерявшими функцию субъединицами VRAC.

Как было предложено рецензентами, сейчас мы выполнили электрофизиологические измерения одновременно с измерениями cFRET. Новые результаты демонстрируют четкую корреляцию изменений cFRET с токами VRAC. Это показывает, что датчик FRET является полезным инструментом для изучения активности VRAC и что C-концы перемещаются во время активации VRAC. Мы не претендуем на строгую роль C-конца в активации VRAC.

2) Одним из основных наблюдений в статье является то, что для наблюдаемых изменений FRET и активации каналов требуется локализация в плазматической мембране.Однако существует значительное количество внутриклеточно расположенных субъединиц LRRC8 даже без обработки BFA (см., Например, LRRC8E-RFP на рисунке 2C), и сигналы FRET, зависящие от гипотоничности, показанные на рисунке 1, по-видимому, исходят из всей клетки (см. Рисунок 1D). Авторы должны устранить это очевидное противоречие и предоставить подробную информацию о том, как они проводили анализ для измерения сигналов, в основном исходящих от плазматической мембраны. Наблюдение, что LRRC8E, по-видимому, в большей степени удерживается в ER, чем LRRC8A (см. Рисунок 2C), кажется, противоречит наблюдению о том, что соотношение 8A / 8E не коррелирует с наблюдаемыми изменениями FRET, за исключением случаев, когда большая часть измеренного сигнала FRET происходит из плазматической мембраны.Авторы должны обсудить эти вопросы.

Благодарим рецензента за поднятие этой проблемы. В самом деле, часть любой субъединицы LRRC8 часто застревает в секреторном пути, как мы наблюдали ранее для экзогенно экспрессируемых комбинаций LRRC8 (Voss et al., 2014). Уровень сигнала, который не поступает от плазматической мембраны, показал высокую вариабельность, при этом некоторые клетки демонстрируют много LRRC8A, а некоторые клетки LRRC8E внутриклеточно. Обычно существует тенденция к тому, что LRRC8E больше застревает в эндомембранной системе, но, что важно, мы не наблюдали корреляции с уровнями экспрессии.Поскольку VRACs могут принимать различные стехиометрии субъединиц, это говорит о том, что количество правильно спаренных (и задействованных) субъединиц также не зависит от уровней экспрессии. Соответственно, мы не наблюдали корреляции между абсолютными нормализованными по акцепторам значениями cFRET и уровнями экспрессии LRRC8E (не показаны). Действительно, сигнал YFP, исходящий из части ячейки с небольшим CFP (LRRC8A), не будет вносить вклад в реальный сигнал FRET правильно сформированных каналов VRAC (см. Отсутствие совместной локализации на рисунке 2C), но он действительно снизит акцептор -нормализованный cFRET (см. уравнение в разделе «Материалы и методы»).Однако, поскольку мы не наблюдали корреляции между уровнями экспрессии и внутриклеточной локализацией, нет никакой корреляции между соотношением экспрессии 8A / 8E и снижением cFRET (Рисунок 1 — приложение к рисунку 2B). Мы согласны с рецензентом, что это важный вопрос, который заслуживает пояснения в рукописи, и поэтому добавили соответствующее утверждение (подраздел «Межсубъединичный FRET показывает движение С-конца во время активации VRAC»).

3) Авторы должны обсудить очевидное противоречие своих данных с наблюдениями в реконструированной системе, где пониженная ионная сила достаточна для активации каналов VRAC.

В самом деле, Syeda et al., (2016) наблюдали активацию комплексов LRRC8, восстановленных в бислоев мембран за счет пониженной ионной силы. До сих пор у нас нет объяснения этому очевидному противоречию, за исключением среды VRAC, то есть системы искусственных мембранных двух слоев по сравнению с клеточным контекстом. В клеточном контексте, однако, есть несколько исследований, подтверждающих активацию VRAC без изменения ионной силы. Кроме того, изменения ионной силы, необходимые для активации VRAC, обычно не достигаются в экспериментах с использованием конфигурации целых клеток для изучения VRAC.Недавно это было подробно рассмотрено Стрэнджем и др. (2019). Следуя предложению рецензента, мы расширили наше обсуждение этого вопроса, добавив также дополнительные цитаты из важных исследований регулирующей роли ионной силы в активации VRAC (раздел «Обсуждение»).

4) Из изображений на Рисунке 3B мне невозможно определить, какие каналы локализованы в ER по сравнению с Гольджи, даже несмотря на то, что авторы использовали маркер для экспрессии Гольджи. Авторы должны использовать маркеры ER, Гольджи и плазматической мембраны, а также предоставить полуколичественный анализ, чтобы продемонстрировать расположение различных популяций каналов, а также предоставить более подробное описание того, как они выбрали свои области интереса для выполнения группового анализа каналов в каждом из каналов. клеточные отсеки.

Мы добавили изображения (новый рисунок 3 — приложение к рисунку 1), показывающие совместную локализацию LRRC8A-CFP-FM2 с маркером ER ER-YFP, маркером Гольджи GalNAc-RFP и с CD4-YFP в качестве маркера плазматической мембраны. после выхода из блока агрегации. Мы предоставляем полуколичественный анализ репрезентативной клетки, в которой мы прослеживаем конструкцию LRRC8A-CFP-FM2 через секреторный путь (Рисунок 3 — видео 1; количественные данные показаны для каждого временного интервала), для которого мы измеряем интенсивность флуоресценции CFP в область Гольджи и ROI для плазматической мембраны (изображено на видео).Мы добавили более подробное описание выбора ROI в подраздел «Система обратной агрегации».

5) На рисунке 1 — приложение к рисунку 1, авторы должны показать чистый FRET, а не нормализованные значения, чтобы позволить читателям увидеть, насколько вариативность FRET была между элементами управления и VRAC.

Чистые значения FRET для наших флуоресцентно меченных субъединиц VRAC сильно различались, при этом измеренная эффективность FRET составляла от 10% до 80%.Вероятно, это связано с гибкой стехиометрией субъединиц гексамерных комплексов VRAC, по крайней мере, при экзогенной экспрессии LRRC8 (например, Gaitán-Peñas et al., 2016). Соответственно, cFRET (то есть скорректированное значение FRET, нормализованное к уровню акцептора) варьировалось в популяции клеток, что требовало нормализации значений. Относительное снижение cFRET во время активации VRAC не зависело от чистого FRET данной клетки, точно так же, как оно не коррелировало с соотношением экспрессии субъединиц (см. Точку 2 и рисунок 1 — приложение к рисунку 2B).Поэтому мы решили не показывать чистые значения FRET, поскольку это не добавит ценной информации. Однако теперь мы указываем вариабельность FRET как причину для нормализации (подраздел «Акцепторное фотообесцвечивание, сенсибилизированное излучение и ратиометрические анализы FRET»). Чистые значения FRET для контрольных конструкций FRET (CFP-18aa-YFP и GluA2-6Y-10C), с другой стороны, показали небольшую вариабельность между клетками, но мы также представляем их как нормализованные значения для ясности.

6) Авторы должны показать, влияет ли лечение LatB или MbCD на чистые уровни FRET, а не только на нормализованные значения.

Чистые значения FRET сильно различаются в зависимости от объясненных ячеек (см. Наш ответ на пункт 5). Среднее значение этого сильно изменчивого значения не изменилось обработкой LatB или MbCD: мы наблюдали среднее (ненормализованное) cFRET 52 ± 15% (необработанные клетки в изотоническом буфере), 45 ± 17% (LatB) и 47 ± 12% (МБКД). Мы предпочитаем не представлять эти данные в рукописи, поскольку считаем, что они не предоставят дополнительную полезную информацию.

7) Аннотация, заголовок и весь текст, по-видимому, подразумевают, что активация PKC связана с физиологической активацией VRAC при воздействии гипотонических растворов.Однако представленные данные на самом деле не устанавливают связь между стимуляцией VRAC PKC и изменениями внеклеточной осмолярности. Вполне может быть, что PKC-стимулированные VRAC действительно активируются ионной силой, и что эта чувствительность скрывается за счет ингибирования PKC. Авторы должны предоставить более подробное обсуждение того, как PKC может влиять на активность канала, даже если оно основано только на предположениях.

Этот аспект рукописи существенно изменился после новых измерений патч-зажима и осознания того, что PKC не так важен, как мы предполагали.Вместо этого мы демонстрируем гораздо более сильную связь с передачей сигналов DAG-PKD, потому что мы можем активировать, ингибировать или поддерживать токи VRAC в отсутствие или в противовес гипотоничности.

Пекарня становится экологичной и сохраняет экологичность — Операции

Чарльз Федер, владелец и оператор Rossmoor Pastries в Сигнал-Хилл, Калифорния, случайно наткнулся на золотую жилу, когда он купил свой первый газовый автомобиль (NGV) на аукционе в апреле 2006 года.Специальный фургон Dodge, работающий на сжатом природном газе (СПГ), с пробегом всего 14 000 миль, стоил 4300 долларов, в то время как фургоны с бензиновым двигателем стоили около 7 000 долларов. Хотя он не был знаком с газомоторными автомобилями и их работой, он не мог отказаться от этой сделки.

Но на этом сделка не закончилась; он увидел значительный потенциал экономии, когда пошел на местную заправку АГНКС. Заправка КПГ стоила 1,50 доллара за галлон, в то время как бензин стоил около 2,50 долларов за галлон. Поскольку пекарня израсходовала 70 галлонов в день на поставки по Южной Калифорнии, Федер понял, что парк КПГ сразу же сэкономит 70 долларов в день.

Впечатленные цифрами, Федер и его деловой партнер Дженис Альгрен вышли и купили еще восемь автомобилей, работающих на КПГ. Они также сообразили, что сэкономят большие деньги, приобретя собственную топливную систему, потому что местная газовая компания будет продавать им природный газ по цене менее 1 доллара за галлон.

Несмотря на то, что компании пришлось сделать первоначальные вложения для покупки автомобилей и создания заправочных мощностей на предприятии, эти затраты были возмещены к апрелю 2007 года.

В то время как большинство жителей Калифорнии волнуются, что цена на бензин превышает отметку в 3 доллара, Федер улыбается, глядя в будущее.«Я коплю кучу денег, я зеленый, и мне нравится то, что я делаю», — говорит он.

Экологически чистый светоотражатель

Федер нашел свои специализированные автомобили, работающие на СПГ, на обычных и государственных автомобильных аукционах, открытых для публики. Правительственные автомобили обычно имеют небольшой пробег и содержатся в хорошем состоянии. Он купил шесть пассажирских фургонов Dodge 1999 года и два фургона Ford E-350 1998 года, каждый со средней пробегом 30 000 миль. Он также купил CNG Crown Victoria. После покупки NGV он продал свой старый парк фургонов Dodge за 18 000 долларов.

В фургоны внесены незначительные изменения. Сиденья были сняты, установлен однодюймовый утепленный пол, а сзади установлены стеллажи для хранения хлебобулочных изделий. Что касается экстерьера, он затонировал окна и добавил логотип компании по бокам фургонов.

Feder рассчитывает, что эти фургоны будут эксплуатироваться долгое время, особенно потому, что топливо горит чисто.

«Эти двигатели служат вечно; они могут проехать 500 000 миль, потому что они бегают так чисто », — говорит Федер.«И я не сжигаю масло. Если хочешь, масла хватит на 10 000 миль ».

Поскольку автомобили, работающие на природном газе, имеют некоторые уникальные системы, очень важно работать с квалифицированным сертифицированным механиком по СПГ. Национальный институт качества автомобильного обслуживания (ASE) проводит сертификационные испытания для технических специалистов по КПГ.

Производители автомобилей обычно предлагают поддержку обученным техническим специалистам. Местные офисы Коалиции за чистые города, а также общественные колледжи и школы автомехаников также могут направить механика по КПГ.

В руководстве по эксплуатации транспортного средства должен быть график осмотра. Баллоны с природным газом необходимо регулярно проверять и сертифицировать механиком по КПГ, особенно если автомобиль попал в аварию. Кроме того, «настройка зазора отличается на свечах зажигания, и датчик O2 должен быть проверен и исправен», — говорит Федер.

По словам Федера, единственным препятствием на пути к использованию парка КПГ является ограниченное количество автомобилей. Хотя Honda по-прежнему продает Civic GX NGV, большинство производителей больше не производят их в коммерческих целях.

Плюс в том, что любое транспортное средство можно переоборудовать в специализированный или двухтопливный газомоторный двигатель. Специальное транспортное средство работает исключительно на природном газе, в то время как двухтопливное транспортное средство имеет два бака для бензина и природного газа. Федер объясняет, что все, что для этого нужно, — это «топливная рампа, бак и регулятор, и вы в деле».

По его словам, переоборудование автомобиля будет стоить около 1800 долларов. Однако переоборудованный автомобиль, работающий на КПГ, может потерять от 10 до 15 процентов мощности.

Коэффициент топлива

Обдумывая свои потребности в топливе, Федер считал, сколько миль его автомобили проехали бы за одну поездку.Баллоны для СПГ меньше, чем бензобаки, и его фургоны могут проехать около 200 миль за одну поездку. Федер говорит, что водители в среднем доставляют пирожные, печенье и сладости по Южной Калифорнии от 130 до 170 миль в день, что позволяет проехать целый день без дозаправки.

«Если транспортным средствам приходится выезжать на большие расстояния, они должны находиться в районах, где на их маршрутах есть заправочные станции», — говорит Федер. У Министерства энергетики США есть веб-сайт, на котором можно найти альтернативные заправочные станции (см. «Полезные ссылки»).

«Мои водители носят карточку со списком станций в этом районе, а у большинства грузовиков есть карты, где они находятся», — говорит Федер.

Министерство энергетики США сообщило, что в октябре 2007 года средняя общенациональная цена на КПГ за галлон составляла 1,77 доллара за галлон по сравнению с 2,76 доллара за обычный бензин. Заправка от компрессора, который забирает газ из местного трубопровода, будет стоить еще дешевле.

Доступно много типов компрессоров. Простым вариантом является установка Phill, заправочного устройства производства FuelMaker, которое подключается к линии природного газа дома или здания.FuelMaker утверждает, что для заправки бензина требуется около четырех часов, чтобы проехать 50 миль.

«Небольшой автопарк может выбрать пару таких маленьких машин, если они соответствуют их требованиям», — говорит Федер. Для его автопарка из восьми грузовиков ему требовался компрессор большего размера и мощности. У него был установлен компрессор Bauer, который производит эквивалент семи галлонов бензина в час. Компрессор подсоединен к трем заправочным колонкам, каждая из которых может одновременно заправлять два автомобиля.

Федер говорит, что установка его собственных компрессоров в пекарне была ключом к экономии денег.Для установки Rossmoor Pastries также получила грант в размере 18 750 долларов США от Района управления качеством воздуха Южного побережья (AQMD). Федер подала заявку на грант через Программу альтернативной топливной инфраструктуры.

Круиз по Карпул-лейн

Как будто экономии тонны денег на расходах на топливо недостаточно, владение парком КПГ дает дополнительные льготы. Владельцам газомоторного топлива предлагаются налоговые льготы штата и федеральные органы власти. Кроме того, во многих штатах автомобили, работающие на альтернативном топливе, могут получить доступ к полосам движения для автомобилей с высокой загруженностью или автобазу.

В Калифорнии владельцы транспортных средств должны подать заявление на получение идентификационной наклейки в Департамент транспортных средств Калифорнии. Поскольку водители Rossmoor Pastries могут использовать автомобильную полосу для доставки, это экономит время и деньги компании.

Помимо финансовой выгоды, именно вклад Федера в улучшение окружающей среды позволяет ему спокойно отдыхать по ночам.

«У меня есть внуки, и я действительно хочу, чтобы мир стал для них лучше», — говорит он. «Я чувствую, что делаю свой вклад в защиту окружающей среды и хочу, чтобы больше людей делали это.”[PAGEBREAK]

Сделай сам: установка собственной заправочной станции КПГ

Найдите подходящую компрессорную систему.

Чарли Федер выполнил свою домашнюю работу, прежде чем приступить к установке компрессорной системы в Rossmoor Pastries. Сначала он изучил линейку компрессоров Ingersoll Rand и обнаружил, что они слишком велики для его нужд. Затем он связался с FuelMaker, чтобы узнать, что они могут предоставить.

Затем из уст в уста он узнал о местной компании, которая установила компрессоры, а также могла оказать поддержку в случае выхода из строя систем пекарни.Федер выбрал эту компанию для работы, и они установили систему производства Bauer Compressors.

Bauer Compressors предлагает обсудить следующие аспекты вашего парка КПГ с производителем или установщиком компрессора, с которым вы решите работать:

— Тип транспорта

— Размер вашего парка КПГ

— Текущий вид топлива флота

— Ежедневный, ежемесячный или годовой расход топлива автопарком

— График заправки флота

— Давление заполнения для автопарка

— Будет ли парк заполнен за ночь (медленное заполнение) или быстро заполнится из хранилища, или комбинация обоих

— Местонахождение планируемой АЗС по перепадам температуры окружающей среды

— Непосредственное окружение планируемой станции (e.г., жилой, коммерческий, индустриальный парк с другими предприятиями поблизости, частная собственность с ограничением шума)

— Как станция будет использоваться: частный флот, общественная заправка или и то, и другое

Обратитесь в соответствующие органы для получения разрешения и помощи.

Муниципалитет, в котором находится ваше здание, обычно является регулирующим органом. Выполняя монтажные работы Rossmoor Pastries, он связался с пожарной службой округа Лос-Анджелес и строительным департаментом города Сигнал-Хилл.Федеру также требовалось разрешение от домовладельца. Вам также может потребоваться одобрение муниципального совета по зонированию, электротехнического инспектора и / или строительного инспектора.

Федер говорит, что хотя компания Signal Hill и окружная пожарная служба никогда раньше не работали с установками для заправки КПГ, они очень помогли в этом процессе. «Это было познавательное путешествие для всех», — говорит он.

Вам также необходимо знать нормы и стандарты, применимые к установке.Наряду с консультациями с городскими властями ознакомьтесь с NFPA 52, который представляет собой Кодекс автомобильных топливных систем Национальной ассоциации противопожарной защиты (www.nfpa.org). Это касается установки автозаправочных станций КПГ.

Обратитесь в местные газовые и электрические компании.

При разговоре с местной газовой компанией Bauer Compressors рекомендует подтвердить, что газ и давление газа доступны на объекте. Также поинтересуйтесь, идет ли подача газа от газопровода, из трубопровода или из скважины.Если газ из скважины, попросите анализ газа, — советует Бауэр. Вы также должны иметь возможность подтвердить качество газа, включая содержание влаги, и то, может ли газовая линия удовлетворить потребности станции в перекачке.

Обратитесь в электрическую компанию в вашем районе, чтобы подтвердить мощность и напряжение, доступные на предприятии, и убедиться, что существующий источник питания может удовлетворить потребность станции в электроэнергии.

Согласуйте работу с подрядчиками, выполняющими установку.

Когда компания Rossmoor Pastries впервые переехала в нынешнее здание, Федер нанял строителя для ремонта помещения. Он связался с тем же строителем, чтобы поработать с установщиком над созданием инфраструктуры для топливной системы.

Полезные ссылки

www.autoauctions.gsa.gov : Администрация общего обслуживания США (GSA) — это федеральное правительственное подразделение, которое продает государственные транспортные средства населению. На сайте есть инструменты для поиска автомобилей, работающих на КПГ (расширенный поиск по типу топлива), и ближайших к вам аукционов.

www.eere.energy.gov/cleancities/progs/coalition_locations.php: Местные офисы Коалиции чистых городов могут помочь вам найти сертифицированного механика по КПГ.

http://afdcmap2.nrel.gov/locator/: Министерство энергетики предоставляет альтернативный локатор заправочных станций.

www.cleancarmaps.com : На этом сайте показаны заправочные станции КПГ в Калифорнии, Неваде и Аризоне

www.eere.energy.gov/afdc/incentives_laws.html: Здесь вы найдете списки федеральных и государственных налоговых льгот, льгот и законов, касающихся транспортных средств, работающих на альтернативном топливе.

Чтобы прочитать больше профилей малых автопарков, щелкните здесь, чтобы увидеть полный список.