Как включить автономку планар: Как включить автономку планар

Изначально будет светиться надпись OF — отключено.

Переведите прибор в режим ON, нажав кнопку со стрелочкой вверх.

После этого ОК. У вас начнут моргать цифры. Делаете все как ранее, пока не появится нужное время включения.

После установки часов и минут, опять высвечивается будильник и моргающие цифры. Это будет настройка времени отключения. Порядок здесь тот же самый.

По окончании такого программирования, печка будет сама запускаться в определенное время и прогревать гараж без вашего участия. Чтобы сбросить настройки, опять нажмите кнопу со звездочкой, и переведите режим будильника из положения ON, в положение OF.

Прокачка топлива

Перед самым первым запуском необходимо прокачать топливо. Для этого одновременно нажимаете две нижние кнопки — OK и «стрелка вниз».

У вас на дисплее загорится надпись «Н» и «OF».

Переключаете на ON.

После этого толчкообразно со щелчками запускается насос. На экране высвечивается соответствующий значок.

Чтобы выключить прокачку, переведите все в режим OF, нажав стрелку вниз. Первым делом при прокачке идет заполнение фильтра.

В конце концов жидкость в трубке должна достигнуть конца шланга топливоподачи.

Натягиваете и зажимаете его хомутом на соответствующем вводе в печку. По завершении прокачки, переходим к первому запуску.

Запуск отопителя и параметры температуры

Нажимаете на дисплее ОК, проверяете выставленную температуру и мощность, и жмете кнопку включения (справа посередине). Вентилятор начинает постепенно набирать обороты.

Если вы подключили устройство через АКБ, то не удивляйтесь, что до момента выхода режима на максимум, будет очень сильная просадка напряжения на два и более вольта. При старте как говорилось выше, ток потребления достигает 10А.

Исходя из этого, аккумулятор у вас должен быть хорошо заряженным. Через какое-то время услышите щелчки подачи топлива от насоса и характерный шум после включения поджига.

Какие реальные параметры будет выдавать этот китайский отопитель на максимуме своих возможностей? Во-первых, температура горячего воздуха даже на самой дальней точке выходного патрубка будет превышать 90 градусов.

А сама внутренняя радиаторная решетка нагреваться до 180С и выше.

На выхлопной трубе газы будут выкидываться с температурой в 150 градусов.

При этом сам пластмассовый корпус печки в нормальном режиме не нагревается выше 50С. Так что не переживайте, ничего там не расплавится и не потечет.

При минимальной мощности в 1,5квт, печка работает практически бесшумно, но и температура на выходе падает до 60С.

Такой режим очень экономичен и полезен поздней осенью или весной, когда нет сильных морозов, но все равно хочется создать в гараже теплую, уютную обстановку.

Разгон и выход отопителя на максимальный режим происходит в течение 5 минут.

Шум от работы вентилятора и печки безусловно будет, но он ни в какое сравнение не идет с шумом от газовой пушки. При работе газовоой установки просто невозможно разговаривать в помещении.

А с этим автономным отопителем можно даже заснуть в дальнем углу на диванчике.

Но самое главное, при правильной сборке и герметизации, от этого отопителя нет никакого запаха, в отличие от тех же газовых и тем более дизельных пушек.

Камера сгорания и нагрева воздуха в китайской вебасте разделены. Поэтому все продукты сгорания полностью вылетают через выхлопную трубу.

Но если вы все же боитесь угореть, и заявления производителей вам не внушают доверия, то для полной безопасности поставьте в гараже датчик СО. Такие тоже продаются на Али. Подробнее

Сколько потребляет солярки китайская вебаста

Какой расход топлива у этого чудо отопителя гаража? На максимальной мощности в 5квт, у вас будет уходить от 400 до 500 грамм дизтоплива. 150 грамм в час — это расход на минимальном режиме.

Данные показатели можно считать вполне приемлемыми для большинства автолюбителей. Работать 24 часа в сутки эта печка у вас не будет. Более того, после выхода на расчетную температуру, запускается «климат контроль».

А еще к этой печке можно приспособить GSM модуль. Тогда вообще запуск будет осуществляться в любое время, с любой точки Земли, прямо с мобильного телефона.

Просыпаетесь утром на работу, тыкаете пальчиком в телефон, и пока приводите себя в порядок и завтракаете, гараж у вас уже натоплен, и машина теплая. Пришли, повернули ключ, завели без проблем и поехали. Лепота!

Вот только солярку для нее заливать желательно чистую и качественную. Иначе можно загубить аппарат. Он постепенно начнет коптить, и в итоге придется разбирать и чистить камеру сгорания и сетку со свечой поджига.

Повышение эффективности и безопасность

Некоторые пугают пожароопасностью данного девайса, тем более при его запуске дистанционно, когда визуально не видно, как он себя фактически ведет. Однако защита у этого «фена» выполнена на профессиональном уровне и за счет кодов ошибок, печка просто не запустится, если что-то пойдет не так.

Для повышения теплоэффективности отдельные пользователи советуют пускать теплый воздух от агрегата по низу в пластиковых канализационных трубах. При чем эти трубы развести по периметру всего гаража и в нескольких местах вырезать отверстия, через которые будет выходить тепло.

Сама труба также прогреется и будет работать как батарея. Идея хорошая, однако такой пластик не теплостойкий и будет выделять всякую дрянь. Поэтому не удивляйтесь, если со временем подхватите какую-нибудь болячку.

Самый главный вопрос, как быстро и до какой температуры эта дизельная автономная печь способна прогреть стандартный гараж 4*6м. Здесь конечно многое зависит от степени теплоизоляции. 

Но как показали реальные испытания этого девайса, даже для плохо утепленного помещения, с щелями в воротах толщиной с палец, такой отопитель способен всего за 1 час нагнать в гараже температуру с 0 до +15С.

Вот вам видеоподтверждение.

Ну а те, кто еще сомневается в надежности и безопасности этого китайского чуда, могут посмотреть видео ниже. В нем специалист ремонтник, профессионально занимающийся именно подобными автономками, провел настоящий краш-тест аналогичной китайской вебасты.

Что с ней только не делалось — перекрывалась подача воздуха и топлива, закупоривалась обратка, ставился неподходящий топливонасос, подавалось пониженное и повышенное напряжение. В общем испытывали ее и в хвост и в гриву.

Как себя при этом вел отопитель, и что с ним в итоге произошло, смотрите своими глазами и не говорите, что не видели.

Узнать текущую цену такого отопителя для гаража и заказать себе подобную модель у китайцев, можно отсюда.

Статьи по теме

Неисправности, коды ошибок воздушных отопителей Планар

Возможные поломки

В процессе эксплуатации могут возникать различные неисправности автономки “Планар”. Система перед каждым запуском проводит диагностику всех устройств, и если есть поломка, она сообщит об этом миганием светодиода на пульте управления. Далее по этому коду можно узнать, что же именно вышло из строя. Можно отремонтировать или же заменить этот элемент.
В инструкции к устройству производитель указывает все возможные ошибки автономки «Планар» и объясняет, как устранить поломку. Но могут возникать и другие поломки, которые невозможно диагностировать при помощи электроники. Так, возможна потеря герметичности теплообменником вследствие его прогорания. Происходит прогар уплотнительных прокладок. Возможно снижение производительности за счет образования нагара внутри теплообменника. Эти поломки можно диагностировать визуально.

В процессе работы могут возникать поломки отдельных блоков – замена их может осуществляться без необходимости демонтажа устройства. Это может быть топливный насос, пульт. Достаточно посмотреть коды ошибок автономки «Планар» и можно будет без труда найти вышедший из строя элемент.

Конструкция и принцип работы

Отопитель имеет регулятор напряжения и таймер. Возможна постоянная работа в автономном режиме. Розжиг запускается электроникой только в случае соблюдения всех требований и при полной исправности составляющих, поэтому нет оснований переживать по поводу безопасности конструкции.

Главные составляющие Планара:

• блок питания;
• элемент для нагрева;
• насос для перекачки топлива.

Принцип работы автономки заключается в подаче воздуха извне в отделение нагрева. Этот воздух нагревает энергия, которая образуется в результате сгорания топлива. После этого тёплый воздух поступает в салон автомобиля, фургона или автобуса.

Планар состоит из 3 основных элементов

Чтобы выставить определённую мощность, нужно зафиксировать в заданном положении специальный регулятор. После того как владелец транспортного средства выберет нужную температуру, отопитель будет поддерживать её самостоятельно в автономном режиме.

Преимущества использования воздушных обогревателей:

• невысокая стоимость;
• небольшой топливный расход;
• работа задаётся по температурному режиму или по мощности;
• при выключенном двигателе во время длительного простоя машины потребляется очень мало электроэнергии;
• не издаёт сильного шума;
• за счёт бесколлекторного двигателя увеличен ресурс работы;
• диагностика конструкции проходит в автоматическом режиме.

В этом видео вы узнаете, как устроен отопитель:

Преимущества Planar 4ДМ2-12-S

Воздушный отопитель российского производства Планар 4ДМ2-12 мощностью 3 киловатта имеет множество сильных сторон:

• Низкий расход топлива. При эксплуатации на минимальном режиме топливный расход составляет всего 120 мл в час.
• Доступная цена. Воздушный отопитель Планар 4ДМ2-12 в разы дешевле устройств зарубежных марок с теми же характеристиками.
• Почти бесшумный. В конструкции автономки используется малошумный бесколлекторный электродвигатель.
• Низкий расход аккумуляторной батареи. Можно не переживать за быстрый разряд аккумулятора, потому что при работе даже в максимальном режиме потребляемая мощность равна 30 Вт.

Ошибки с устройства управления Планар (с маркировкой S)

Неисправности, возникающие во время работы отопителя, кодируются и автоматически отображаются на индикаторе пульта управления.

Пульт управления ПУ-22

Вы можете сами устранить следующие неисправности указанные в таблице ниже.

* — только для воздушных отопителей Планар 8ДМ-12/24-S

** Внимание! Если во время запуска или работы отопителя ошибка «Перегрев» повторится 3 раза подряд, то отопитель будет заблокирован. Блокировка производится по факту перегрева, независимо от датчиков, по которым зафиксированы ошибки. В случае блокировки на пульте управления будет отображаться 33 код. Для разблокирования отопителя необходимо обратиться в сервисный центр.

Неисправности с которыми лучше обратиться в специализированный сервисный центр.

* — только для воздушных отопителей Планар 8ДМ-12/24-S

Модельный ряд устройств

Модельный ряд включает 4 устройства — 2Д, 4 ДМ, 44Д и 8 ДМ.

Коды ошибок отопителя Планар для каждого устройства отличаются. Зная, как они расшифровываются, можно понять причину неисправности и приступить к её устранению.

Планар 2Д-12/24, Планар 44Д-12/24, Пранар 8ДМ-12/24

* — новый код неисправности

Планар 4Д-12/24, Планар 8Д-12/24

Планар 4ДМ-12/24, Планар 4ДМ2-12/24

Планар 2Д-12/24 / Планар 44Д-12/24 / Планар 8ДМ-12/24

01 — Перегрев теплообменника

Причины

Датчик выдает сигнал на выключение отопителя. Температура теплообменника в зоне датчика более 250ºС.

Рекомендации по ремонту

• Проверить входное и выходное отверстия нагревателя на предмет свободного прохождения через нагреватель воздуха
• Проверить целостность вентилятора и его работу
• Проверить датчик при необходимости заменить
• Проверить теплообменник
• Проверить и при необходимости снять нагар с внутренней части теплообменника

02 — Возможный перегрев по датчику температуры

Причины

Температура датчика (блока управления) более 55 градусов. За время продувки перед запуском в течение 5 минут недостаточно охлаждён блок управления или перегрев блока управления, который произошел во время работы.

Рекомендации по ремонту

• Проверить входной и выходной патрубки нагревателя на предмет свободного входа и выхода воздуха и повторить запуск для охлаждения отопителя
• Проверить блок управления
• Заменить блок управления

04 — Неисправность датчика температуры в блоке управления

Причины

Вышел из строя датчик температуры (находится в блоке управления замене не подлежит).

Рекомендации по ремонту

• Проверить блок управления, при необходимости заменить

05 — Неисправность датчика

Причины

Короткое замыкание на корпус или обрыв в электропроводке датчика.

Рекомендации по ремонту

• Проверить датчик
• Заменить датчик

06 — Неисправность датчика температуры в блоке управления

Причины

Вышел из строя датчик температуры (находится в блоке управления замене не подлежит).

Рекомендации по ремонту

• Проверить блок управления, при необходимости заменить

08 — Прерывание пламени при работе отопителя

Причины

• Негерметичность топливопровода
• Неисправность топливного насоса
• Неисправность индикатора пламени

Рекомендации по ремонту

• Проверить герметичность топливопроводов
• Подтянуть хомуты на топливопроводах
• Проверить воздухозаборник
• Проверить газоотводящий трубопровод
• Проверить количество и подачу топлива топливным насосом и при необходимости заменить его
• Если отопитель запускается, то проверить датчик и при необходимости заменить

09 — Неисправность свечи накаливания

Причины

• Неисправность свечи накаливания
• Короткое замыкание, обрыв, неисправность блока управления

Рекомендации по ремонту

• Проверить свечу накаливания, при необходимости заменить
• Проверить блок управления, при необходимости заменить

10 — Электродвигатель нагнетателя воздуха не набирает необходимых оборотов

Причины

• Повышенное трение в подшипниках или задевание крыльчатки за улитку в нагнетателе воздуха
• Неисправность электродвигателя

Рекомендации по ремонту

• Проверить электродвигатель нагнетателя воздуха

12 — Отключение, повышенное напряжение

Причины

• Повышенное напряжение более 30 В (более 16 В для 12 В отопителя)
• Неисправен регулятор напряжения
• Неисправна аккумуляторная батарея

Рекомендации по ремонту

• Проверить клеммы на аккумуляторной батарее
• Проверить подводящую электропроводку
• Проверить аккумуляторную батарею, при необходимости зарядить или заменить
• Проверить работу регулятора напряжения автомобиля, при необходимости отремонтировать или заменить

13 — Отопитель не запускается, исчерпаны две автоматические попытки запуска

Причины

• Нет топлива в бачке
• Марка топлива не соответствует условию эксплуатации при низких температурах
• Недостаточное количество подаваемого топлива
• Засорен газоотводящий трубопровод или воздухозаборник
• Недостаточный разогрев свечи, неисправность блока управления
• Крыльчатка задевает за улитку в нагнетателе воздуха и, как следствие, уменьшается подача воздуха в камеру сгорания
• Засорено отверстие диаметром 2,8 мм в камере сгорания
• Засорена свечная сетка или установлена не до упора в штуцере камеры сгорания

Рекомендации по ремонту

• Залить топливо в бачок.
• Заменить топливо.
• Устранить негерметичность топливопровода
• Проверить на производительность топливный насос, при необходимости заменить.
• Очистить воздухозаборник газоотводящий трубопровод от возможного засорения.
• Проверить свечу, при необходимости заменить. Проверить напряжение подаваемое блоком управления, при необходимости заменить. (Напряжение должно быть не менее 12 В).
• Заменить нагнетатель воздуха после определения его неисправности.
• Прочистить отверстие диаметром 2,8 мм
• Заменить при необходимости сетку

15 — Отключение, пониженное напряжение

Причины

• Пониженное напряжение более 30 В (более 16 В для 12 В отопителя)
• Неисправен регулятор напряжения
• Неисправна аккумуляторная батарея

Рекомендации по ремонту

• Проверить клеммы на аккумуляторной батарее
• Проверить подводящую электропроводку
• Проверить аккумуляторную батарею, при необходимости зарядить или заменить
• Проверить работу регулятора напряжения автомобиля, при необходимости отремонтировать или заменить

16 — За время продувки датчик температуры не остыл

Причины

За время продувки перед запуском в течение 5 минут недостаточно охлаждён датчик температуры.

Рекомендации по ремонту

• Охладить датчик температуры

17 — Неисправность топливного насоса

Причины

Короткое замыкание или обрыв в электропроводке топливного насоса.

Рекомендации по ремонту

• Проверить электропроводку топливного насоса на короткое замыкание и обрыв
• Проверить провода, идущие на датчик перегрева, на целостность изоляции

20 — Отопитель не запускается

Причины

• Перегорели предохранители на жгуте питания
• Нет связи между пультом управления и блоком управления
• Пульт управления не получает данные с блока управления

Рекомендации по ремонту

• Проверить предохранители при необходимости заменить
• Проверить соединительные разъемы и зеленый провод в переходном жгуте. Удалить окисление с контактов разъемов
• Проверить пульт управления и переходной жгут, при необходимости заменить. Если пульт работает, то необходимо заменить блок управления

27 — Двигатель не вращается

Причины

• Окисление контактов в колодке
• Двигатель заклинил по причине разрушения подшипника, магнитопласта (ротора) или попадания посторонних предметов и. т. п.

Рекомендации по ремонту

• Проверить разъемы и жгуты, идущие к плате электродвигателя и блоку управления. Устранить неисправности

28 — Двигатель вращаться с постоянной скоростью (не поддается управлению)

Причины

• Неисправность платы управления электродвигателя
• Неисправность блока управления

Рекомендации по ремонту

• Проверить плату управления электродвигателя
• Проверить блок управления
• Проверить и при необходимости заменить нагнетатель воздуха

29 — Прерывание пламени при работе отопителя

Причины

• Негерметичность топливопровода
• Неисправность топливного насоса
• Неисправность индикатора пламени

Рекомендации по ремонту

• Проверить герметичность топливопроводов
• Подтянуть хомуты на топливопроводах
• Проверить воздухозаборник
• Проверить газоотводящий трубопровод
• Проверить количество и подачу топлива топливным насосом и при необходимости заменить его
• Если отопитель запускается, то проверить датчик и при необходимости заменить

30 — Отопитель не запускается

Причины

• Нет связи между пультом управления и блоком управления
• Блок управления не получает данные с пульта управления

Рекомендации по ремонту

• Проверить соединительные разъемы и белый провод в переходном жгуте
• Удалить окисление с контактов разъемов
• Проверить пульт управления и переходной жгут, при необходимости заменить
• Если пульт работает, то необходимо заменить блок управления

78 — Зафиксирован срыв пламени во время работы

Причины

• Воздух в топливной системе
• Неисправность топливного насоса
• Неисправность индикатора пламени

Рекомендации по ремонту

• Проверить герметичность топливопроводов
• Подтянуть хомуты на топливопроводах
• Проверить воздухозаборник
• Проверить газоотводящий трубопровод

Планар 4Д-12/24 / Планар 8Д-12/24

01 — Перегрев теплообменника

Количество миганий: 1

Рекомендации по ремонту

• Проверить входной и выходной патрубок нагревателя на предмет свободного входа и выхода нагреваемого воздуха
• Проверить датчик перегрева на теплообменнике, при необходимости заменить

05 — Неисправность индикатора пламени

Количество миганий: 5

Рекомендации по ремонту

• Проверить цепь индикатора пламени на обрыв, при этом сопротивление между выводами должно быть не более 1 Ом. Если индикатор неисправен, то его необходимо заменить.

08 — Прерывание пламени

Количество миганий: 3

Рекомендации по ремонту

• Проверить количество и подачу топлива
• Проверить систему подвода воздуха для сгорания
• Проверить газоотводящий трубопровод
• Если отопитель запускается, то проверить индикатор пламени и при необходимости заменить

08 — Неисправность свечи накаливания

Количество миганий: 4

Рекомендации по ремонту

• Проверить свечу накаливания, при необходимости заменить

10 — Неисправность мотора нагнетателя воздуха

Количество миганий: 11

Рекомендации по ремонту

• Проверить электропроводку мотора нагнетателя воздуха
• При необходимости заменить нагнетатель воздуха

12 — Отключение (повышенное напряжение или пониженное напряжение)

Количество миганий: 9

Рекомендации по ремонту

• Проверить аккумуляторную батарею
• Проверить регулятор напряжения
• Проверить подводящую электропроводку

Напряжение между 1 и 2 контактами разъема ХР13 должно быть не выше 30В (15В).

Напряжение между 1 и 2 контактами разъема ХР13 должно быть не ниже 21,6В (10,8В).

13 — Попытки запуска исчерпаны

Количество миганий: 2

Рекомендации по ремонту

• Если допустимое количество попыток запуска использовано – проверить количество и подачу топлива
• Проверить систему подвода воздуха для сгорания
• Проверить газоотводящий трубопровод

16 — Превышено время на вентиляцию

Количество миганий: 10

Рекомендации по ремонту

За время продувки недостаточно охлаждён нагреватель.

• Проверить систему подачи воздуха для сгорания
• Проверить газоотводящий трубопровод
• Проверить индикатор пламени и при необходимости заменить

17 — Неисправность топливного насоса

Количество миганий: 7

Рекомендации по ремонту

• Проверить электропровода топливного насоса на короткое замыкание
• Проверить топливный насос, при необходимости заменить

20 — Нет связи между пультом управления и блоком управления

Количество миганий: 8

Рекомендации по ремонту

• Проверить соединительные провода и разъемы между пультом управления и блоком управления

Разблокировка Планар-8ДМ. Сброс 33 кода блокировки.

** Внимание! Если во время запуска или работы отопителя ошибка «Перегрев» повторится 3 раза подряд, то отопитель будет заблокирован.
Блокировка производится по факту перегрева, независимо от датчиков, по которым зафиксированы ошибки. В случае блокировки на пульте управления будет отображаться 33 код.
Для разблокировки отопителя необходимо сначала выяснить в каком году он был произведен:
Для первой версии отопителей выпускаемых (01.2014 – 03.2015) сброс блокировки осуществляется только при помощи специальной программы установленной на компьютер или у нас в СЦ.
Для второй версии отопителей выпускаемых (03.2015 – текущее время) сброс блокировки можно осуществить двумя способами:
1) При помощи специальной программы.
2) Своими силами.
Алгоритм сброса блокировки БЕЗ использования компьютера:
■ Подключить изделие к источнику питания, запустить изделие, подождать появление 33 кода.
■ После появления кода, в течении 30 сек необходимо разъединить разъем питания на жгуте или любым другим способом отсоединить питание от отопителя.
■ Повторить данную процедуру 3 раза подряд.
Если в течении 30 сек не разъединить разъем питания, то всю процедуру нужно будет начать сначала.
После 3 сбросов питания отопитель будет разблокирован.

Технические характеристики

Рассмотрим популярную модель 4ДМ 12 24. Это тоже автономка «планар». Цена ее составляет 19 400 р. Устройство являет собой дизельный автономный отопитель. Аппарат имеет следующие технические характеристики.

Так, уровень производства тепла составляет в активном режиме работы 3 кВт, а в малом – 1 кВт. Топливо расходуется на активном режиме в количестве 0,36 л/ч. В малом режиме прибор потребляет до 0,12 л/ч. Потребляемая мощность — до 30 Вт. Нагнетаемый воздух – 120 м3/ч. Питающее электрическое напряжение составляет 12 и 24 В. Все эти характеристики были замерены при номинальных питающих напряжениях и температуре в 20 градусов. Возможна небольшая погрешность при измерениях.

Особенности и достоинства

Автономка «Планар» изготавливается в Самаре на предприятии «Адверс». Компания занимается производством и продажей различной климатической техники, которая очень востребована на территории России. Основное преимущество продукции предприятия – доступные цены и высокое качество оборудования.
Автономные отопители могут эффективно и надежно выполнять свои функции даже при воздуха до -45°С. Также среди достоинств прибора – компактные размеры. Отопитель не займет в салоне автомобиля много места. Использование прибора значительно упрощено за счет того, что система укомплектована пультом дистанционного управления. С помощью его можно включать и выключать устройство, а также изменять различные режимы работы автономки.

Вся продукция, которая производится компанией «Адверс», имеет необходимые сертификаты, которые полностью подтверждают безопасность и соответствие стандартам качества. Автономка «Планар» в процессе работы расходует незначительное количество топлива, за счет чего обеспечивается продолжительное время использования. Монтаж можно осуществить самостоятельно. Это позволяет существенно сэкономить

Также еще одно важное преимущество, которое имеет автономка «Планар», — цена. На дизельную модель мощностью в 7,5 кВт она составляет 28 300 р

Это гораздо ниже, чем стоимость аналогичной продукции европейских производителей.

Источники

• https://www.tproekt.com/avtonomka-planar-opisanie-ustrojstvo-osobennosti-montaza-i-rekomendacii/
• https://kaminguru.com/obsluzhivanie/kody-neispravnostej-planar.html
• https://shop.vanlife.ru/planar-4dm2-12/
• https://autoclimate.online/error/planar
• https://kodobd.ru/oshibki-planar/
• https://avtonomka.srv58.ru/cod_error_planar.html

[свернуть]

Отопитель Планар в Буханку — идеальное для идеального go-patriot.ru

Отопитель Планар в Буханку — идеальное для идеального

Немного о том, как установить автономный отопитель Планар в УАЗ 452 «Буханка». И о том, как этот самый отопитель себя показал в реальных условиях эксплуатации. Нет, не в езде под подмосковными ЛЭП, а в нормальном таком зимнем путешествии.

Залез тут поглядеть статистику по сайту. Оказалось, что недавняя заметка про автономный отопитель для УАЗ Патриот весьма и весьма востребована. Народ вовсю интересуется сухими фенами, процессами их установки и отзывами об эксплуатации.

Наша редакция в лице меня активно следит за социальными запросами читателей. Кто, если не мы напишет гражданам всю правду-матку, с железками, мазутными руками и без маркетинга?

В общем, вы хотели узнать, как лучше всего установить отопитель Планар на Буханку — вы пришли по адресу

Почему лично я предпочитаю Планар, уже написано ранее. Повторяться не буду. Дешевизна, доступность запчастей, хорошая статистика работы у меня и знакомых — вот причины выбора. Предпочитаете другого производителя — берите его, я даже спорить не буду.

Почему для Буханочки я взял модель не на 4 кВт, а всего на 2 кВт? Тут тоже всё просто.

Во-первых, четырехкиловатный фен больше по размеру. В то самое место, куда я хотел его внедрить он бы не встал без нарушений инструкции. А инструкция чётко требует обеспечить столько-то сантиметров отступа от краёв и стенок.

Во-вторых, четырехкиловатный во всех наших северных приключениях работал на минимальной мощности, на трех-четырёх делениях из десяти. Это, говорят, не сильно здорово. Типа, отопителю лучше работать на максимуме, чем на минимуме. Так будет меньше нагара в камере сгорания.

В-третьих, рано или поздно я сделаю дублирование системы отопления при помощи какого-нибудь газового отопителя. Поставлю себе какой-нибудь мажорский Truma. Но это не точно. И чем больше я смотрю на их цены, тем неточнее моё решение.

1. Отопитель воздушный ПЛАНАР-2D-12-S. Одна штука.
2. Бак топливный БТ13 (на 13 л). Одна штука. Раньше в комплекте вроде был бак, а теперь нужно брать отдельно.
3. Труба выхлопная в борт (для катеров и яхт, с монтажным комплектом). Одна штука. Сейчас о ней расскажу.

Отопитель и топливный бак — это обычные штуки. Их берут 99 % покупателей. Но я на основе опыта решил сделать конструкцию немного хитрее и удобнее.

Хитрость первая — труба выхлопная от яхт. Офигенная штука. На фотках ниже сразу поймёте, что она нужна на 100%. Выглядит вот так.

Хитрость вторая — правильный выбор пульта управления. Когда я покупал отопитель, они штатно комплектовались пультом ПУ-22. Сейчас, как я понимаю, его заменили на более передовой ПУ-27М.

Вот так вот выглядит пульт ПУ-22.

Чем он хорош? На него можно подцепить дополнительные датчики. Его можно программировать, настраивать режимы отопления, включать паузы и проветривания.

Штука хорошая, но все эти примочки лично мне не нужны. Мне нужен более примитивный функционал — кнопка «включил-выключил» и крутилка «болше-мэнше».

Такой пульт называется ПУ-5 и выглядит вот так. Его и берём.

Начинаем устанавливать отопитель в конкретно взятый УАЗик

Всё просто и элегантно.

Для начала выкидываем штатную буханковскую печку. Она будет неистово мешаться, пусть пока полежит в сторонке. Нам нужна ниша за пассажирским сиденьем.

В полу ниши сверлим по шаблону нужные отверстия.

Не будьте таким же бараном, как я. Заранее проверьте, что у вас есть сверла нужного диаметра. Иначе… будете шарошить дырки чем попало.

Примеряем фен. Встаёт как родной. С боков нужные допуски от стенок. Со стороны выхода горячего воздуха тоже есть нужное расстояние для загиба гофры.

Дальше всё вообще просто. Провода все промаркированы. Разъемы совпадают только с тем, чем надо. Соединить неправильно — невозможно!

Видите «маму» — ищите такого же «папу».

Насос поселил рядом с отопителем на арку.

Перед прикручиванием выковырял из крепежа насоса металлическую втулку. Мне кажется, что так насос будет тише «чакать», так будет меньше вибраций передаваться на металл.

Гофру для горячего воздуха вывел в салон через перегородку. Тоже ничего сложного, пару резов болгаркой.

А вот с выхлопной трубой пришлось повозиться. Никто же не проверил наличие соответствующих свёрел, а уродовать отверстие фрезой не сильно хотелось.

Нашли балеринку. Интересно, она сможет просверлить борт? Картонку, вот, режет просто отлично.

Не, не смогла балеринка справиться с кузовным металлом УАЗика. Только краску содрала.

Да и пофигу. Попробуем лобзиком. Лобзик точно справится.

Делов-то! Надо было сразу брать лобзик!

Готово! Автономный отопитель Планар на буханку установлен! Можно ехать для испытаний в какое-нибудь холодное место

Как вам Монголия в начале января? Пригодное место для испытаний?

Год назад куча народу сразу бросилась крутить пальцем у виска и говорить, что в январе мы в одну машину точно погибнем или как минимум поимеем больших проблем. Но мы не погибли, а отлично так прокатились. Вон, даже рассказ в трёх частях написали.

Отопитель показал себя хорошо.

Сразу скажу, что жарко нам не было. Но и машина была утеплена только наполовину, отсутствовала почти вся обшивка, а из дверей неистово дуло.

Планар старался на полную и таки нагревал щелястый сарай до приемлемой температуры. Этим летом я заборол щели в дверях, должен быть вообще Ташкент.

По потоком горячего воздуха мы сушили обувь и варежки, разогревали еду.

А насколько уютнее спать под мерное чаканье насоса…

Даже внешний вид машины становится уютнее, если из её борта идёт дымок.

В общем, мне понравилось. И фен хороший, и место подобрано идеальное.

Понравилась запись? Поделитесь с друзьями! =)

— обзор

3.16.7 Рекомендации по выбору технологий

Автономные системы разрабатываются в отдаленных районах, где нет электросети. Из-за рассредоточенности населения, характерного для районов Южного Средиземноморья и Персидского залива, для удовлетворения потребностей в питьевой воде в отдаленных деревнях используются относительно небольшие системы. Основными желательными характеристиками таких систем являются низкая стоимость, низкие требования к техническому обслуживанию, простота эксплуатации, а также высокая надежность [9].

Решение об использовании автономной солнечной опреснительной системы, а также выбор наиболее подходящей комбинации зависят от нескольких параметров и в основном зависят от конкретной площадки.

Для солнечных опреснительных систем наиболее важным параметром, касающимся системы электроснабжения, является достаточный солнечный потенциал в выбранном регионе. Другими факторами, которые следует принимать во внимание и которые влияют на окончательную удельную стоимость воды и срок службы станции, являются наличие земли, стоимость земли, а также наличие технического персонала и местного рынка.

Что касается опреснения, необходимо изучить ряд основных параметров. Первый — это оценка общих водных ресурсов. Это должно быть сделано как с точки зрения качества, так и количества (для ресурсов с солоноватой водой). Во внутренних районах солоноватая вода может быть единственным выходом. В этих случаях следует проявлять осторожность при утилизации рассола и отбраковывать их, не загрязняя местные водные ресурсы.

На прибрежных участках обычно имеется морская вода. В этом случае при сбросе солевого раствора в море соблюдаются особые правила.

Процессы дистилляции используются в основном для опреснения морской воды, в то время как мембранные процессы используются для широкого диапазона солености от солоноватой воды до морской воды.

Применение процесса ED является предпочтительным для опреснения солоноватой воды.

Определение качества производимой воды зависит от назначения завода, например, от того, используется ли растение для питьевых, сельскохозяйственных или промышленных нужд. Процессы дистилляции используются для производства дистиллятной воды, а мембранные процессы — для производства питьевой воды.Однако при дополнительной обработке дистиллятной воды можно также производить питьевую воду; с помощью установки обратного осмоса двойного назначения можно производить воду с очень низкой проводимостью.

С точки зрения энергии, основным источником энергии для опреснительной установки является большой ввод тепла. Как и все термические процессы, дистилляция требует больших затрат энергии (из-за энергии, необходимой для изменения фазы). Кроме того, для перекачки требуется дополнительное электричество (электричество можно производить с помощью фотоэлектрических станций).

С другой стороны, солнечные тепловые системы настолько сильно зависят от излучения (день / ночь), что всегда требуется некоторое аккумулирование тепла. Таким образом, аккумулятор может стать основной подсистемой установки, и принятые стратегии управления приобретают особое значение.

Для испарителей MSF PR увеличивается с повышением температуры, поэтому предпочтительны высокие температуры (до 120 ° C). Это, в свою очередь, увеличивает риск образования накипи и коррозии. Испарители MED в настоящее время работают при более низких температурах (около 70 ° C), и эти опасности уменьшаются.

Наконец, управление такими испарителями должно быть очень точным, особенно уравновешивание вспышки в MSF. Система нестабильна при малых размерах. Это приводит к использованию испарителей среднего и большого размера (производительность в тысячи кубометров в день), которые не совсем соответствуют размерам и производительности, обычно применяемым с возобновляемыми источниками энергии, если только не может быть построено огромное солнечное поле, что, в свою очередь, подразумевает большие грунтовые поверхности. Таким образом, сочетание солнечно-термической дистилляции лучше всего подходит для средних и высоких производственных мощностей.

С другой стороны, RO доступен в большом диапазоне размеров и солености воды. Использование устройств рекуперации энергии может значительно снизить потребность в энергии. Стабильность источника питания важна для срока службы мембраны.

ED доступен также в небольших размерах; однако этот процесс в основном используется для опреснения солоноватой воды из-за зависимости потребления энергии от концентрации питательной воды.

Простота эксплуатации и технического обслуживания, а также автоматизация системы являются серьезной проблемой.

Нелегко найти коммерческую зрелость в солнечных опреснительных установках; однако существует достаточное количество растений, которые могут быть подтверждены путем их исследования.

ODE_Main.dvi

% PDF-1.6 % 975 0 объект > эндобдж 972 0 объект > поток GPL Ghostscript 8.632008-10-07T11: 24: 30-04: 002008-10-07T11: 09: 48-04: 00dvips (k) 5.96dev Авторские права 2007 Radical Eye Software 2008-10-07T11: 24: 30-04: 007b270d41- 96dd-11dd-0000-b530c606d50euuid: 44fcc442-01eb-4036-b036-623c810e6343application / pdf

страница не найдена — Williams College

Миниатюрные плоские телескопы для эффективного, широкоугольного и высокоточного управления лучом

Угловое увеличение с помощью плоского телескопа

На рисунке 1a сравниваются три различных способа управления направлением света независимо от положения падающего света, включая дифракцию решетки, поверхность преломление и угловое увеличение.Для дифракционных решеток решетка сообщает падающему пучку фиксированную компоненту импульса в плоскости. Следовательно, угол выходного луча не имеет постоянного увеличения по сравнению с углом падения. При поверхностной рефракции импульс в плоскости сохраняется на границе двух различных сред. В параксиальном приближении выходной пучок может иметь фиксированное увеличение в соответствии с законом Снеллиуса. Однако с точки зрения реальных сценариев приложений средства ввода и вывода должны быть одинаковыми, и увеличения не будет.Для сравнения, для идеального углового увеличения угол падающего луча должен быть увеличен с фиксированным коэффициентом увеличения (в параксиальном приближении), и различные входные и выходные среды не требуются. В этом случае устройство добавляет различные компоненты импульса в плоскости к пучкам с различными входными углами. Эта функция вряд ли может быть реализована с помощью однослойного POE.

a Схема регулировки направления света с помощью дифракции на решетке, поверхностного преломления и углового увеличения.В первом случае решетка добавляет к падающему свету постоянную компоненту импульса в плоскости независимо от его угла падения. Во втором случае при поверхностной рефракции компонент импульса в плоскости сохраняется, но выходной угол масштабируется до угла падения по закону Снеллиуса. В третьем случае для идеального углового увеличения устройство добавляет к падающему свету компоненту импульса в плоскости с фиксированным масштабным коэффициентом, а входная и выходная среда одинаковы. b Иллюстрация плоского телескопа, состоящего из двух POE для достижения углового увеличения.{\ boldsymbol {m}} \) импульсная составляющая решетки в плоскости, M коэффициент увеличения, планарные оптические элементы POE.

Каскадный POE с заданным фазовым градиентом возможен для реализации углового увеличения, где простейшим случаем является наложение двух POE, как показано на рис. 1b. Для удобства мы назначаем определенные импульсы в плоскости POE I (\ (p_1 (x_1) \)) и POE II (\ (p_2 (x_2) \)) и называем расстояние между этими двумя POE как d . Поскольку ПОЭ на основе ЖК-полимера является тонким (порядка 1 мкм), в параксиальном приближении его отклик можно рассматривать как локальный.Тогда легко доказать, что если один из POE имеет пространственно инвариантный импульс в плоскости (\ (p_i \ left ({x_i} \ right) = C \), где C — константа), каскадный устройство не может иметь коэффициент увеличения по углу, отличный от 1. Следовательно, эти два POE требуют пространственно изменчивого импульса в плоскости. Таким образом, минимальное требование требует наличия двух POE с линейно изменяющимся импульсом в плоскости: \ (p_1 \ left ({x_1} \ right) = c_1x_1 \) и \ (p_2 \ left ({x_2} \ right) = c_2x_2 \ ), где c _i — константа первого порядка.Можно показать, что если условие, \ (- \ frac {d} {k} = \ frac {1} {{c_1}} + \ frac {1} {{c_2}} \) ( k , волновой вектор света), каскадный POE будет выполнять функцию увеличения угла с коэффициентом масштабирования \ (M = — c_2 / c_1 \) (дополнительное примечание 1). По сути, это принцип работы традиционных телескопов с приближением тонкой линзы. Однако ни один из традиционных аналогов не может обеспечить низкую стоимость, легкий вес и плоскую форму, которые крайне необходимы для компактных устройств поворота балки.

Для реализации плоского телескопа необходимы как минимум два POE с линейно изменяющимися импульсами в плоскости. В 2D-пространстве это линзы с параболическим фазовым профилем. Посредством моделирования трассировки лучей доказано, что каскадные POE с простыми параболическими фазовыми профилями выполняют функцию увеличения угла. Однако по мере увеличения угла падения качество пятна выходного луча немного ухудшается (дополнительный рисунок S1a). Хотя это небольшое ухудшение не будет критичным для многих приложений, характеристики отклонения от угла можно дополнительно улучшить за счет включения фазовых членов более высокого порядка.Пример оптимизированных конструкций показан на дополнительном рисунке S2. По сравнению с конструкцией с параболическими фазовыми профилями, его характеристики при отклонении от угла значительно улучшены (дополнительный рисунок S1b).

Жидкокристаллические планарные оптические элементы

Благодаря большому двулучепреломлению и природе самосборки ЖК являются отличными материалами для реализации геометрических фаз (GP, также известных как фаза Панчаратнума – Берри) на основе POE ^14,15 . Для POE пропускающего типа GP формируется с помощью входящего света с круговой поляризацией, проходящего через слой ЖК с пространственно изменяющейся анизотропией.{i \ Gamma / 2}} \ end {array}} \ right] {\ mathbf {R}} (\ varphi) \\ & = & \ cos \ frac {\ Gamma} {2} {\ mathbf {I} } — i \ sin \ frac {\ Gamma} {2} \ left [{\ begin {array} {* {20} {c}} {\ cos \ left ({2 \ varphi} \ right)} & {\ sin \ left ({2 \ varphi} \ right)} \\ {\ sin \ left ({2 \ varphi} \ right)} & {- \ cos \ left ({2 \ varphi} \ right)} \ end { массив}} \ right] \ end {array} $$

(1)

, где R — матрица вращения, I — единичная матрица, а Γ — задержка фазы ЖК.Фазовая задержка связана с толщиной ЖК-слоя ( t ), двулучепреломлением (Δ n ) и волновым вектором падающего света ( k ) как Γ = t Δ nk . {\ pm i2 \ varphi} $$

(2)

Уравнение (2) имеет несколько следствий: (1) Выходной сигнал имеет два состояния ортогональной поляризации, где часть с перевернутым спином накладывается на GP, равное ± 2 φ .2 \ left ({{{\ Gamma}} / 2} \ right) \) таким образом, что полуволновое замедление приводит к максимальной эффективности.

Если в качестве примера взять каскадный POE с параболическими фазовыми профилями, если номинальное фокусное расстояние f _i назначено каждому POE, константа первого порядка c _i связана с f _i как c _i = — k / f _i , расстояние между этими двумя POE становится \ (d = f_1 + f_2 \), а коэффициент увеличения оказывается \ (M = — f_1 / f_2 \).Чтобы получить компактный дизайн с большим увеличением, величина f ₁ должна быть намного больше, чем величина f ₂ , но иметь обратный знак. Между тем форм-фактор должен быть микромасштаб. Было реализовано несколько методов для создания LC-выравнивания для микромасштабных POE, включая прямую лазерную запись ²² , наноимпринт ²⁴ , проекцию мета-маски ²⁸ и ретранслируемую поляризационную голографию ⁴² .Среди них поляризационная голография является наиболее рентабельной и создает непрерывный фазовый профиль. Однако предыдущая поляризационная голография вряд ли может быть использована для создания небольших микролинз с числом f ( f / #) из-за наличия громоздкого светоделителя перед плоскостью экспонирования. Здесь мы предлагаем новый метод, а именно поляризационную голографию встречных волн (подробности см. В дополнительном рис. S3 и в разделе «Материалы и методы») для создания желаемых шаблонов выравнивания ЖК.Благодаря этой стратегии два записывающих луча с круговой поляризацией падают на плоскость экспонирования с противоположных направлений, что устраняет проблему использования светоделителя перед плоскостью экспонирования.

В экспериментах были изготовлены три типа полимеризованных ЖК-РОЭ с f / # 5,5, 3,3 и 2,0, соответственно. В верхнем ряду рис. 2 показаны визуальные изображения массивов POE, размещенных над шахматной доской. Размер каждого квадратного POE составляет 3 на 3 мм ² , а расстояние между POE и фоном шахматной доски составляет 6 мм.Для f /2 POE номинальные фокусные расстояния составляют ± 6 мм для двух ортогональных состояний круговой поляризации. В этом случае можно четко идентифицировать только изображение объектива −6 мм. Аналогичный эффект визуализации можно заметить для POE f /3,3 и f /5,5. Центральный вид изображений поляризованного оптического микроскопа (POM) для POE показан в нижнем ряду рис. 2. Полосы с постепенно изменяющимися периодами ясно иллюстрируют желаемую фазовую картину. На вставке (голубые квадраты) показано распределение директора ЖК в выбранной области, которая непрерывно вращается в радиальном направлении.Для POE с большим f / # период полос под POM явно больше. Важно отметить, что для метода экспонирования на основе поляризационной голографии окончательная фазовая диаграмма на образцах в основном зависит от формы и качества шаблона.

Верхний ряд: оптические изображения массивов 4 на 4 изготовленных POE f /2, f /3,3, f / 5,5. POE размещаются на расстоянии 6 мм от фона шахматной доски.Эффект визуализации POE можно четко идентифицировать. Красные квадраты выделяют отдельные POE. Нижний ряд: изображения с помощью поляризованного оптического микроскопа изготовленных POE с различными f / #. POE вставляются между двумя линейными поляризаторами. Модуляция интенсивности демонстрирует пространственно изменяющееся выравнивание ЖК. Для POE с меньшим размером f / # такое пространственное изменение распределения директора ЖК более драматично. Голубые квадраты выделяют распределение директоров ЖК выбранной области.Анализатор, П-поляризатор.

Характеристики управления лучом планарных телескопов

Для оценки характеристик предлагаемых миниатюрных планарных телескопов создана измерительная установка, имитирующая их практическое применение. Как показано на рис. 3a, коллимированный лазерный луч с круговой поляризацией ( λ = 488 нм) падает на каскадные POE, а его угол падения регулируется поворотным зеркалом (M2). Испытаны два модуля планарных телескопов на основе каскадных ЭП.Модуль I состоит из f / 5.5 POE I и f /3.3 POE II, а модуль II состоит из f / 5.5 POE I и f /2 POE II. Расстояние между двумя POE контролируется как ~ 6,6 мм для модуля I и ~ 10,5 мм для модуля II. Выходной угол и эффективность управления как функция углов падения регистрируются, как показано на рис. 3b, c, для модулей I и II, соответственно. Подбирая соотношение выходного угла и угла падения с помощью линейной функции, модуль I показывает наклон, равный 1.68, что хорошо согласуется с расчетным коэффициентом увеличения 1,67. Такое согласие также справедливо для модуля II, измеренный наклон которого составляет 2,73, а расчетный наклон — 2,75.

a Схема измерительной установки. Лазерный луч с круговой поляризацией с длиной волны 488 нм падает на плоский телескоп, состоящий из двух POE. Зеркало (M2) закреплено на поворотном столике для управления углами падения.L-лазер, P-поляризатор, фильтрация и расширение FE, зеркало M1 I, диафрагма I, зеркало M2 II, четвертьволновая пластина QWP, экран Sc. b Производительность модуля I, который состоит из f /5,5 POE I и f /3,3 POE II. c Производительность модуля II, который состоит из POE I f / 5,5 и POE II f /2. Измеренные данные представлены символами, а сплошные линии представляют собой визуальные ориентиры. Овалы и стрелки выделяют ось y , которой соответствует набор данных.См. Подробные сведения об измерениях в разделе «Материалы и методы».

Для обоих модулей измеренная эффективность рулевого управления остается выше 84,6% (модуль I:> 89,8%; модуль II:> 84,6%), что обеспечивает низкие потери энергии при угловом увеличении в пределах падающего поля зрения. Из-за проблем с лазерной безопасностью низкие потери являются очень желательной особенностью в практических приложениях управления лучом, таких как автономные транспортные средства и дисплеи, расположенные близко к глазу. Обратите внимание, что при нормальном падении эффективность не достигает 100%, что может быть приписано небольшой дымке POE и небольшому отклонению от оптимальной рабочей длины волны.Согласно нашим измерениям, мутность POE f /5,5, f /3,3 и f /2 составляет 1,7%, 2,2% и 3,4% соответственно. Мутность возникает из-за нескольких факторов. Например, большая шероховатость поверхности ЖК-полимера приведет к большей матовости, и несовпадение ЖК также может способствовать. Но, к счастью, более качественное покрытие может еще больше улучшить общее качество и повысить эффективность рулевого управления ^26,29 . Для справки: ЖК-линзы промышленного качества с геометрической фазой дюймового размера с аналогичным f / # могут достигать мутности до 1%.2 \ left ({{{\ Gamma}} / 2} \ right) \) закон. При наклонном падении эффективность может наблюдаться для обоих модулей и более выражена для модуля II. Это можно понять по зависимости угла падения от POE. Как показывают изображения POM, POE показывают градиентные локальные шаги решетки, и наименьший шаг решетки для f /2 POE (~ 2,0 мкм, параболическая фаза) намного меньше, чем у f /3,3 (~ 3,2 мкм, параболическая фаза) POE. Для меньшего шага решетки уменьшение дифракционной эффективности первого порядка в зависимости от углов падения более очевидно, как показано численно на дополнительном рис.S5. Тем не менее, это принципиально не ограничивает производительность устройства, поскольку уже было продемонстрировано, что ЖК-структуры с несколькими перекрутками компенсируют потерю эффективности при отклонении от угла ³⁰ .

За исключением потерь энергии, вызванных дымкой, отклонением рабочей длины волны и утечкой света под углом, все остальное следует отнести на счет аберрации волнового фронта POE, возникающей в результате примененного нами метода изготовления. Здесь стандартная (неоптимизированная) асферическая линза используется в качестве шаблона в нашем шаблоне фотоориентации интерференционной экспозиции.Чтобы устранить эту аберрацию волнового фронта, можно настроить лучшую линзу-шаблон или реализовать другой метод формирования фотошаблонов, такой как прямая лазерная запись или проецирование мета-маски. Наше моделирование с отслеживанием лучей (дополнительный рис. S1) доказывает, что если разработанные фазовые профили назначены обоим POE, все устройство может иметь почти дифракционно ограниченные характеристики. В результате эта часть потерь энергии может быть полностью компенсирована более совершенной инженерией. Если принять во внимание все возможные методы компенсации потерь, в идеальном случае эффективность может достигать 98%.

Для некоторых приложений управления лазерным лучом важно сохранять форму луча после управления. Чтобы записать форму выходного луча, создается установка для определения характеристик, как показано на рис. 4а (слева). Форма луча как функция угла падения для обоих модулей фиксируется путем регулировки положения камеры относительно угла падения (рис. 4a, справа). Зарегистрированная форма пучка представлена ​​на рис. 4б, в для модулей I и II соответственно. В пределах диапазона углов падения выходной луч сохраняет круглую форму.Что еще более важно, оптического виньетирования не наблюдается. Это означает, что в диапазоне падения ± 5 ° на POE I весь отклоненный свет направляется на POE II, и, таким образом, достигается максимальная эффективность.

a Слева: Схема измерительной установки. Лазерный луч с круговой поляризацией с длиной волны 488 нм падает на плоский телескоп, состоящий из двух POE. Зеркало (M2) закреплено на поворотном столике для управления углом падения.Камера, соединенная с фильтром нейтральной плотности, применяется для записи пятен выходного лазерного луча, и местоположение камеры смещается в соответствии с углом поворота M2. Справа: угол записи камеры в зависимости от угла падения. L-лазер, P-поляризатор, фильтрация и расширение FE, зеркало M1 I, диафрагма I, зеркало M2 II, четвертьволновая пластина QWP, фильтр нейтральной плотности NDF, C-камера. b Зарегистрированная форма луча модуля I в зависимости от углов падения. c Зарегистрированная форма луча модуля II в зависимости от углов падения.

Для дальнейшего исследования изменения волнового фронта при угловом увеличении с помощью предлагаемого миниатюрного планарного телескопа используется система формирования изображений 4 f , показанная на рис. 5a, для характеристики свойств изображения. Во-первых, снимаются изображения групп 2 и 3 в таблице испытаний разрешения ВВС США 1951 года без POE, как показано в левой части рис. 4b, c, соответственно. Затем в систему 4 f вставляется планарный модуль телескопа, состоящий из f /3.3 POE I и f /2 POE II с расстоянием ~ 4 мм.Центр планарного телескопа расположен на плоскости 2 f . Соответствующие изображения представлены в правой части рис. 4б, в. Как видно, планарный телескоп увеличивает пространственную частоту света в плоскости Фурье, что приводит к увеличению изображений на плоскости изображения. Большинство деталей хорошо восстановлено, за исключением небольшого ореола. Призрачные изображения могут быть приписаны легкой дымке POE, которая рассеивает свет на плоскости Фурье. С улучшенным покрытием можно ожидать гораздо лучших характеристик изображения.

a Схема измерительной установки. Лазерный луч с круговой поляризацией с длиной волны 488 нм падает на тестовую таблицу разрешения USAF 1951 года, которая затем отображается системой 4 f . Планарный модуль телескопа, состоящий из f /3.3 POE I и f /2 POE II, размещается на плоскости 2 f . Записываются изображения с модулем планарного телескопа и без него. L-лазер, P-поляризатор, FE-фильтрация и расширение, четвертьволновая пластина QWP, тестовая таблица T, линза L1 I, линза L2 II, камера C.Фокусное расстояние L1 и L2 составляет 15 см. b Захваченные изображения группы 2 тестовой карты разрешения без (слева) и с (справа) планарного телескопа. c Захваченные изображения группы 3 тестовой таблицы разрешения без (слева) и с (справа) планарного телескопа.

«Полярность плоских клеток и нейроразвитие» Саймона Сан

DOI

https://doi.org/10.25772/1T53-E113

Аннотация

Планарная клеточная полярность (PCP) — это онтогенетический сигнальный механизм, который устанавливает полярность в плоскости эпителия.Было показано, что PCP играет роль в управлении многочисленными процессами развития нервной системы, такими как конвергентное расширение, миграция нейронов и поиск пути аксонов. Определенные комиссуральные нейроны в спинном мозге принимают ряд руководящих решений на пути к головному мозгу: сначала вентральная проекция вдоль оси DV, затем пересечение средней линии и после выхода из пластинки пола, дорсо-передний поворот вдоль AP. ось. Здесь мы предоставляем доказательства in vivo, что аксоны нейронов Commissural Primary Ascending (CoPAs) у рыбок данио нуждаются в генах PCP fzd3a, vangl2 и scribble для поиска рострального пути как до, так и после пересечения средней линии.Дорсовентральное наведение аксонов CoPA не изменяется у мутантов fzd3a, vangl2 и scribble, указывая тем самым, что путь передачи сигналов PCP контролирует только A-P-направление CoPA. Наши результаты предоставили доказательства для двух потенциальных не исключающих друг друга моделей: (i) управление аксоном AP достигается клеточно-автономной передачей сигналов Wnt-Frizzled или что (ii) управление аксоном AP достигается не-клеточно-автономной передачей сигналов PCP в нейроэпителиальная среда. Одноклеточная природа системы аксонов CoPA позволяет выполнять простые генетические манипуляции и визуализацию, что потенциально может пролить свет на обоснованность любой модели.Scribble (Scrib), член семейства LAP, играет решающую роль в установлении и регулировании поляризации клеток в эпителии и во время миграции клеток. У рыбок данио мутанты Scrib имеют дефекты движений конвергентных клеток вытяжения (CE) и миграции лицевых брангиомоторных нейронов (FBMN). Несмотря на наше понимание генетической роли Scrib в развитии нервной системы, мало что известно о субклеточной локализации эндогенного Scrib in vivo во время миграции CE и FBMN. Мы создали моноклональные антитела против С-конца Scrib рыбок данио и показали, что это антитело специфично против эндогенных Scrib как в вестерн-блоттинге, так и в иммуноцитохимических применениях.Конфокальная микроскопия иммуноцитохимии Scrib показывает, что на различных стадиях развития Scrib отчетливо локализуется на базолатеральных мембранах неполяризованного эпителия, на мембране мезодермальных клеток, подвергающихся CE, и на мембране мигрирующих FBMNs. Более того, распределение Scrib puncta вдоль мембран контакта FBMN-FBMN значительно изменено у мутанта PCP pk1b. Дальнейшее применение наших недавно созданных антител Скриба потенциально приведет к новому пониманию роли Скриба в развитии нервной системы.

Передача сигналов узловой и планарной полярности клеток взаимодействует для регуляции конвергенции и расширения гаструляционных движений рыбок данио

Существенных изменений:

1) Тот факт, что фенотип MZoep ухудшается из-за отсутствия Vangl2, указывает на то, что оба пути необходимы для CE эктодермы. Тем не менее, неясно, в какой степени Nodal может также функционировать выше передачи сигналов PCP. В частности, доказательства того, что передача сигналов PCP частично нарушена у мутантов MZoep, не совсем убедительны.Чтобы укрепить этот вывод, было бы хорошо проверить, например, (i) в какой степени фенотип MZoep CE может быть спасен активацией PCP и (ii) какой аспект передачи сигналов PCP (динамическая субклеточная локализация, уровень экспрессии, оборот и т.д.) может частично зависеть от передачи сигналов Nodal.

На основании наших исследований мутантов MZ oep мы предполагаем, что передача сигналов PCP частично активна в отсутствие передачи сигналов Nodal и что эти два пути работают в значительной степени параллельно in vivo.Однако две части данных указывают на то, что передача сигналов PCP несколько нарушена в MZ oep — / — gastrulae. Во-первых, несмотря на то, что мы показываем, что WT и мутантные клетки демонстрируют сопоставимое обогащение Prickle-GFP на их передних клеточных мембранах, мы также отмечаем, что мутантные клетки демонстрируют повышенную долю Pk-GFP puncta, которая не ограничивается передними краями клеток по сравнению с WT. (Рисунок 2A). Это оказалось наиболее надежным считыванием статуса передачи сигналов PCP во время гаструляции и демонстрирует умеренный фенотип PCP у мутантов с дефицитом Nodal.Во-вторых, мы включили новые данные РНК-секвенирования, непосредственно сравнивающие экспрессию генов между совпадающими стадиями MZ oep — / — и WT-эмбрионами на 90% стадии эпиболии. Анализ этих данных показывает, что экспрессия большинства генов PCP не изменилась в MZ oep — / — по сравнению с WT, но основной компонент PCP prickle1b значительно снижен у этих мутантов, снова демонстрируя умеренное влияние на функцию PCP. Эти данные включены в новую панель A на рисунке 2 — приложение к рисунку 1 и описаны в разделе результатов.

Обработанные данные секвенирования РНК включены в качестве файлов исходных данных 1 и 2, а необработанные данные о последовательностях были депонированы в омнибус экспрессии генов NCBI под регистрационным номером GEO: GSE147302. Рецензенты могут получить доступ к этим данным перед публикацией с помощью ключа рецензента wveduewuxlknfmp.

Наконец, наши исследования эксплантатов бластодермы показывают, что передача сигналов PCP действует ниже Nodal в поляризации ML клеток и удлинении эксплантов (Figure 5).

Хотя мы согласны с тем, что было бы идеально подавить фенотип потери функции Nodal путем активации передачи сигналов PCP, этот эксперимент, насколько нам известно, невозможен.Нет надежных нижестоящих мишеней передачи сигналов PCP, которыми можно было бы надежно манипулировать во время гаструляции.

2) Если на CE влияет потеря активности Nodal, можно ожидать расширения нервной пластинки, аналогично находкам для vangl2 MO. Однако эмбрионы MZoep на самом деле имеют более узкие нервные пластинки, чем WT (Figure 2E, F), подрывая предположение, что Nodal регулирует CE.

Это интересный момент. В статьях, впервые описывающих фенотипы Nodal-дефицитных мутантных эмбрионов рыбок данио (включая MZ oep ), отмечается, что удлинение почти полностью блокируется, но что другие гаструляционные движения эпиболии и конвергенции остаются неизменными (1, 2).Как указывает рецензент, конвергенция нейроэктодермы очевидна, но почему это приводит к более узкой нервной пластинке, чем WT, неизвестно. Кроме того, хотя конвергенция внутри мутантов MZ oep , несомненно, имеет место, предыдущие сообщения демонстрируют, что скорость и устойчивость конвергентных клеток нервной пластинки внутри мутантов MZ oep значительно снижены по сравнению с WT на стадиях постгаструляции (3), обеспечивая экспериментальные доказательства для нарушенной конвергенции, а также для расширения.Чтобы лучше охарактеризовать движения конвергенции и разгибания в гаструлах MZ oep — / — и сравнить их количественно с WT, мы повторно проанализировали наши данные четырехмерного ядерного отслеживания, чтобы независимо оценить смещение клеток в медиолатеральном (конвергенция) и переднезаднем (разгибание) измерениях . Построив эти данные о направленном смещении в зависимости от положения клетки внутри эмбриона, были выявлены характерные наклоны, представляющие движения конвергенции и вытяжения, соответственно. Мы также количественно оценили абсолютное смещение вдоль каждой оси у эмбрионов каждого генотипа.Такой анализ показал, что, хотя конвергенция все еще наблюдалась у мутантов MZ oep — / -, смещение клеток в измерении ML было значительно снижено по сравнению с WT. Расширение AP также было серьезно нарушено с точки зрения как абсолютного смещения, так и пространственной организации клеточных движений. Эти новые анализы были добавлены на рис. 1 и описаны в разделе «Результаты».

Кроме того, почему маркеры на рисунке 2E более интенсивно окрашены у эмбрионов MZoep по сравнению с WT?

Наши новые данные РНК-seq, сравнивающие WT и MZ oep — / — gastrulae, демонстрируют, что dlx3b экспрессируется на несколько более высоких уровнях в мутантах MZ oep , что может объяснять более сильное окрашивание.Это дополнительно усугубляется увеличением плотности клеток в результате уменьшения разрастания нейроэктодермы у этих мутантов (2). Мы включили эти данные экспрессии RNA-seq в новую панель D на рисунке 2 — рисунок в приложении 1 и кратко обсудим это в разделе результатов.

3) Утверждение «Ориентация выступов MZoep — / — клеток была также лишь частично улучшена в пределах хостов WT (Рисунок 1I)» не поддерживается и должна быть скорректирована, поскольку графики на Рисунке 1H и у меня похожи.Интересно открытие, что клетки MZoep, трансплантированные хозяевам дикого типа, демонстрируют почти нормальную ориентацию выступов. Зависит ли это от поляризации окружающих клеток и будет ли, например, эктодермальные клетки дикого типа иметь более случайную ориентацию выступов при трансплантации в MZoep?

Для статистического анализа ориентации выступов измеренные ориентации были объединены в один из 12 секторов (по 30 °, всего 360 °), которые затем были классифицированы как медиолатеральные (в пределах 60 ° от горизонтали), переднезадние (в пределах 60 ° от вертикали), или ни то, ни другое (оставшиеся 120 °).Эти бункеры имеют цветовую кодировку на диаграммах выступающей ориентации в виде розы на Рисунке 1M. Распределение выступов внутри каждой из этих категорий затем сравнивалось между экспериментальными условиями с использованием критериев хи-квадрат. Этот анализ показал, что распределение выступов в клетках MZ oep — / -, трансплантированных хозяевам WT, значительно отличалось от контрольных MZ oep — / — и MZ oep — / — (p <0,0001) и WT от WT. контроли (p = 0,0053), показывая, что, хотя полярность их выступов была улучшена средой WT, они не выстраивались в такой же степени, как клетки WT.Эти результаты описаны в разделе «Результаты», а этот анализ - в разделе «Материалы и методы».

Клетки MZ oep — / -, трансплантированные в нейроэктодерму хозяев WT, демонстрируют значительно улучшенное выравнивание их клеточных тел, а ориентация выступов действительно демонстрирует неавтономный эффект на плоскую поляризацию клеток. Хотя было бы интересно узнать, верно ли это для реципрокного эксперимента (доноры WT в MZ oep — / — хозяева), мы не решались провести этот эксперимент, потому что результаты было бы слишком трудно интерпретировать.Когда клетки WT трансплантируются в мутанты MZ oep , они имеют тенденцию становиться мезодермой, и было бы трудно подтвердить, что донорские клетки были нейроэктодермальными (для сравнения «апельсины с апельсинами»).

4) Используя эксплантаты бластодермы, авт. Предполагают, что конвергентные движения в этой системе ex vivo зависят от передачи сигналов Nodal и что Nodal действует выше передачи сигналов PCP. Однако расширение эксплантата или выравнивание клеток не обязательно является показателем движений конвергенции.Чтобы утверждать это, необходимо показать фактические движения конвергенции ячеек.

Чтобы решить эту проблему, мы выполнили автоматическое отслеживание клеток 4D в эксплантатах с ядерной меткой как с эктопическим ndr2 , так и без него. Эти данные были проанализированы таким же образом, как и данные отслеживания интактных эмбрионов, и дали удивительно похожие результаты. Клеточные треки внутри эксплантатов, экспрессирующих ndr2 , наблюдались, двигаясь внутрь из боковых положений при перемещении наружу вдоль оси растяжения, контрольные признаки C&E.Далее, построив график смещения вдоль каждой оси в зависимости от положения клеток, мы видим наклоны, которые очень похожи на таковые у WT эмбрионов, все сильно наводящие на мысль о C&E как первичном морфогенетическом механизме расширения эксплантата. Эти данные были включены в новые панели G-K на Рисунке 3 и описаны в разделе «Результаты».

Возможно ли, что удлинению способствует общее увеличение клеточных движений или дифференциальная пролиферация?

Чтобы рассмотреть возможность дифференцированной или локализованной пролиферации, мы вручную аннотировали деления клеток в пределах покадровой серии эксплантатов с ядерной меткой и нанесли их расположение относительно центра каждого экспланта.Мы обнаружили, что деления клеток были сконцентрированы вдоль оси растяжения, и хотя это может частично отражать удлиненную форму эксплантатов, экспрессирующих ndr2 , это указывает на возможную роль клеточных делений в удлинении ex vivo. Однако количество клеточных делений на этих стадиях развития ex vivo относительно невелико. Более того, статья, недавно опубликованная в eLife , продемонстрировала, что блокирование клеточных делений в эксплантах бластодермы рыбок данио не предотвращает их распространение (4).Мы также не наблюдали «горячей точки» распространения, которая указывала бы на область роста. Вместе эти данные предполагают, что дифференциальная пролиферация может играть небольшую роль в расширении эксплантата, но вряд ли будет вносить существенный вклад. Эти данные показаны в новом дополнении к рисунку, Рисунок 3 — Приложение к рисунку 2, и описаны в разделе «Результаты».

Поляризуется ли локализация Prickle-GFP в эксплантатах?

Чтобы оценить локализацию Pk-GFP в интактных эмбрионах, разреженное мечение было достигнуто путем трансплантации клеток из эмбрионов, инъецированных РНК, кодирующей Pk-GFP (и h3B-RFP), в эмбрионы хозяина.Из-за их небольшого размера такие трансплантации между эксплантами были невозможны. В качестве альтернативного подхода мы попытались добиться разреженного мечения в эксплантах с помощью мозаичных инъекций в один из шестнадцати бластомеров, но не смогли наблюдать надежные точки Pk-GFP.

Кроме того, инъекция лигандов Nodal также индуцирует спецификацию энтодермы и мезодермы, которые отсутствуют в неинъектированном контроле. Активация передачи сигналов PCP во время расширения эксплантата может быть обусловлена ​​присутствием энтодермы и мезодермы скорее, чем из-за активности передачи сигналов Nodal как таковой.Медикаментозное лечение для блокирования передачи сигналов Nodal после приобретения клеточной судьбы может быть возможным экспериментом для определения необходимости непрерывной активности передачи сигналов Nodal.

Фактически мы уже провели этот точный эксперимент, который был включен во вторую, совместно представленную рукопись, посвященную независимым от мезодермы ролям Nodal в C&E. Поскольку эта вторая рукопись не была рекомендована к публикации, мы переместили эти данные на новый рисунок 6 для текущей пересмотренной рукописи.Мы действительно обнаружили, что ингибирование передачи сигналов Nodal после спецификации мезодермы значительно снижает удлинение ex vivo, и далее обнаружили, что Nodal способствует удлинению эксплантатов, лишенных экспрессии маркеров мезодермы. Вместе эти результаты демонстрируют, что непрерывная передача сигналов Nodal (как таковая) необходима для полного расширения эксплантата. Этот новый рисунок 6 сопровождается двумя дополнениями к рисункам, рисунок 6 — дополнениями к рисункам 1 и 2 и описан в разделе «Результаты».

Бумага также выиграет от более четкого различия между удлинением и CE.Это очень важно, так как эффект Nodal в принципе может быть больше связан с миграцией прехордальной пластинки, чем с CE.

Мы согласны с тем, что различие между расширением и C&E важно, т.к. морфогенетические механизмы, отличные от C&E, безусловно, вносят вклад в удлинение AP. Однако мы считаем маловероятным, что миграция прехордальной пластинки (ppl) способствует расширению эксплантата по следующим причинам:

1) Высокораспространяющиеся эксплантаты из эмбрионов, которым инъецировали 10 мкг ndr2 , не экспрессируют маркеры для ppl, такие как gsc (рис. 3 — приложение к рисунку 1).

2) Мы наблюдали экспрессию gsc в эксплантах из эмбрионов, которым инъецировали более высокие дозы ndr2 (25-100 пг), но это, по-видимому, обратно коррелирует со степенью их распространения (Рисунок 3 — рисунок в приложении 1), аргументируя это тем, что против представления, что расширение эксплантата управляется миграцией прехордальной пластинки.

5) Nodal действует локально, а не широко по всему эмбриону (см. Рисунок 4 — приложение к рисунку 1 и Xu et al., 2014).Как Nodal мог бы регулировать поведение клеток далеко в нейроэктодерме?

Van Boxtel et al., 2015 (5) демонстрируют, что существует низкий уровень активации передачи сигналов нижестоящими Nodal внутри нервной пластинки рыбок данио на стадиях гаструляции. Более того, Sampath et al., 1998 (6) показали, что cyc / ndr2 экспрессируется в аксиальной мезодерме до 90% эпиболии — таким образом, чуть ниже нейроэктодермы, подвергающейся C&E.

6) Выводы основаны на «значительных различиях» между экспериментальными условиями, определенными статистическими тестами.Однако величина эффекта часто очень мала, а различия в экспериментальных группах велики. Низкие значения p являются следствием очень большого количества образцов, но биологическое значение определенной величины эффекта остается неясным. Поэтому авторы должны применить методы начальной загрузки или повторной выборки, используя подмножества из распределений данных, чтобы проверить, воспроизводимы ли размеры эффекта.

Как и в любой сложной живой системе, форма, выравнивание и движения клеток (как и следовало ожидать) очень изменчивы в пределах живых эмбрионов.Вот почему мы количественно оценили, как отметил рецензент, большое количество клеток и / или эмбрионов для каждого эксперимента. Однако мы не согласны с тем, что размеры результирующего эффекта малы или незначительны. Хотя разница между ориентацией 20 ° и 45 ° может показаться несущественной, это разница между сильно поляризованной (20 °) и случайно ориентированной (45 °) ячейкой. И хотя не каждая клетка даже у WT-эмбриона достигнет такого уровня поляризации, наша статистика демонстрирует, что как популяция, эти клетки сильно поляризованы, а мутантные клетки значительно меньше.В соответствующие рисунки мы включили отдельные точки данных для всех измерений наших клеток и эксплантов, чтобы четко определить, насколько изменчивы данные этого типа. Однако эти графики могут вводить в заблуждение и предполагать, например, что популяции клеток менее хорошо поляризованы, чем они есть. Чтобы лучше представить различия между группами, в отредактированной рукописи мы изменили наши графические представления формы и выравнивания ячеек (на рисунках 1, 2 и 5) на графики скрипки. Отдельные точки данных по-прежнему включены, но мы считаем, что эти графики более четко иллюстрируют «форму» каждого набора данных в целом и подчеркивают важные различия между ними.Один пример показан на рисунке 1J.

7) Непонятно, почему эмбрионы, равномерно инъецированные ndr2, дают поляризованные эксплантаты. Было бы хорошо показать, что наличие асимметрии не зависит от асимметричной инъекции лигандов Nodal, например путем проведения гибридизационного окрашивания in situ с зондами для введенного ndr2 (возможно, с тегом GFP или тому подобным, чтобы отличить его от эндогенно продуцируемых узлов).

Мы действительно предполагаем, что небольшие асимметрии, возникающие в результате инъекции, усиливаются с помощью передачи сигналов Nodal с обратной и прямой связью (7), поскольку невозможно гарантировать идеально равномерное распределение введенной РНК.Это связано с тем, что 1) мы вводим небольшой объем в 1 нл в эмбрион диаметром 600 мм, и мы редко попадаем в точный центр, и 2) у нас нет контроля над потоком цитоплазмы, который распределяет цитоплазму и введенные РНК между клетки раннего зародыша. Мы включили небольшой раздел в раздел «Обсуждение», описывающий этот предполагаемый источник асимметрии (пятый абзац). Хотя нам, безусловно, интересно выяснить истоки этой асимметрии в будущих исследованиях, мы не чувствуем, что то, как возникает асимметрия, каким-либо образом влияет на нашу интерпретацию представленных данных или какие-либо выводы, сделанные на их основе.

Если введенный ndr2 равномерно распределен, требуется ли автоактивация Nodal для поляризации, т.е. что происходит в эмбрионах MZsqt; cyc?

Хотя мы предполагаем, что в наших инъецированных экспериментальных эмбрионах Nodal не может быть равномерно распределен, мы были бы также рады провести этот эксперимент, чтобы проанализировать роль аутоактивации Nodal. Однако, учитывая, что этот эксперимент потребует сложной задачи трансплантации зародышевой линии для получения мутантов MZ, у нас не было ни времени, ни ресурсов, чтобы завершить его своевременно.

8) Авторы заявляют, что «Хотя гены PCP wnt5b, vangl2 (трилобит) и gpc4 (knypek) экспрессировались на явно нормальных уровнях в MZoep — / — гаструлах при гибридизации in situ целиком (WISH) (рисунок 2 — рисунок приложение 1Б) », но данные этого не показывают; вместо этого все гены, по-видимому, активируются у эмбрионов MZoep. Пожалуйста, скорректируйте выводы.

Как упоминалось выше, с тех пор мы включили данные РНК-seq, демонстрирующие, что большинство генов PCP, включая wnt5b, vangl2 и gpc4 , экспрессируются на нормальных уровнях в мутантах MZ oep .

Артикул:

1) Фельдман Б., Гейтс М.А., Иган Э.С., Дуган С.Т., Реннебек Г., Сироткин Н.И. и др. Развитие организаторов рыбок данио и формирование зародышевого листка требует сигналов, связанных с узловыми точками. Природа. 1998; 395 (6698): 181-5.

2) Грицман К., Чжан Дж., Ченг С., Хекшер Э., Талбот В.С., Шир А.Ф. Одноглазая булавочная головка белка EGF-CFC необходима для узловой передачи сигналов. Клетка. 1999; 97 (1): 121-32.

3) Арая С., Ток М., Гирдлер Г.С., Коста М., Кармона-Фонтейн С., Кларк Дж. Д.. Мезодерма необходима для скоординированных клеточных движений внутри нервной пластинки рыбок данио in vivo.Neural Dev. 2014; 9: 9.

4) Шауэр А., Пинейро Д., Хаушильд Р., Гейзенберг С.П. эмбриональные эксплантаты подвергаются генетически закодированной самосборке. eLife . 2020e55190.

5) van Boxtel AL, Chesebro JE, Heliot C, Ramel MC, Stone RK, Hill CS. Временное окно для активации сигнала определяет размеры узловой сигнальной области. Dev Cell. 2015; 35 (2): 175-85.

6) Сампат К., Рубинштейн А.Л., Ченг А.М., Лян Дж.О., Фекани К., Сольница-Крезель Л. и др. Индукция вентрального мозга рыбок данио и пластинки дна требует передачи сигналов cyclops / nodal.Природа. 1998; 395 (6698): 185-9.

7) Мюллер П., Роджерс К.В., Джордан Б.М., Ли Дж.С., Робсон Д., Раманатан С. и др. Дифференциальная диффузия Nodal и Lefty лежит в основе системы формирования паттерна реакция-диффузия. Наука. 2012; 336 (6082): 721-4.

CLAMP / Spef1 регулирует передачу сигналов плоской клеточной полярности и накопление асимметричных микротрубочек в мерцательном эпителии Xenopus | Журнал клеточной биологии

Большинство эпителиальных клеток поляризуются вдоль оси ткани, что называется плоской полярностью клеток (PCP).Инициирование PCP требует передачи сигналов между клетками через неканонический путь Wnt / PCP. Кроме того, изменения в цитоскелете как облегчают, так и отражают эту полярность. Мы определили CLAMP / Spef1 как новый регулятор передачи сигналов PCP. Помимо украшения микротрубочек (MT) и ресничного корешка, пул CLAMP локализуется в апикальной клеточной коре. Истощение CLAMP ведет к потере асимметрии белка PCP, дефектам полярности ресничек и дефектам угла деления клеток. Кроме того, истощение CLAMP приводит к потере атипичной кадгерин-подобной молекулы Celrs2, предполагая, что CLAMP способствует стабилизации межузловых взаимодействий, ответственных за правильную локализацию белка PCP.Истощение CLAMP также влияет на поляризованную организацию MT. Мы предполагаем, что CLAMP облегчает установление клеточной полярности и способствует асимметричному накоплению MTs после установления собственно PCP.

Способность клеток координировать поляризацию в плоскости ткани требует как межклеточной передачи сигналов через путь плоской клеточной полярности (PCP), который происходит в месте межклеточных контактов, так и внутриклеточной интеграции этого сигнала через цитоплазматические изменения в цитоскелет.Фундаментальные аспекты передачи сигналов PCP сохраняются на протяжении всей эволюции, и большинство основных компонентов были первоначально обнаружены у Drosophila melanogaster , где волоски и щетинки на основе актина поляризованно выступают в клетках крыла и брюшка (Goodrich and Strutt). , 2011). Хотя глобальные сигналы, которые устанавливают передачу сигналов PCP, остаются плохо изученными, есть доказательства того, что смещенный направленный трафик, основанный на микротрубочках, может влиять на установление PCP (Shimada et al., 2006). Более того, механическое напряжение, такое как силы, генерируемые во время движений тканей, связанных с гаструляцией (или искусственным растяжением), достаточно для облегчения асимметрии PCP (Chien et al., 2015).

Хотя обычно считается, что большинство эпителиальных клеток поляризованы, отсутствие явно поляризованных структур ограничивает количество типов клеток, которые можно использовать для экспериментального анализа.У позвоночных координация клеточной полярности четко проявляется в мультицилийных клетках (MCCs), обнаруженных в мерцательном эпителии, таком как трахея, яйцевод и эпендима, все из которых продуцируют поток жидкости, управляемый поляризованными ресничками. Правильная поляризация ресничек, как хорошо известно, требует передачи сигналов PCP (Park et al., 2008; Mitchell et al., 2009; Guirao et al., 2010; Vladar et al., 2012; Boutin et al., 2014). Кроме того, напряжение сдвига, механическое напряжение, динамика микротрубочек (МТ) и актина координируются для образования МКЦ с правильно выровненными ресничками (Mitchell et al., 2007; Guirao et al., 2010; Вернер и др., 2011; Владар и др., 2012; Chien et al., 2015). У людей генетическая потеря потока жидкости, управляемого поляризованными ресничками, приводит к повышенному риску гидроцефалии, бесплодия и респираторных инфекций (Bush and Hogg, 2012). Более того, передача сигналов PCP управляет многочисленными событиями развития, включая гаструляцию, конвергентное расширение и образование нервной трубки (Wallingford, 2005a, b). Здесь мы идентифицируем новый регулятор передачи сигналов PCP, CLAMP / Spef1, который модулирует межклеточные коммуникации посредством атипичного кадгерина, Celsr2, и способствует асимметричной локализации белка PCP и нисходящей асимметричной функции MT.

CLAMP представляет собой MT-ассоциированный белок, который динамически связывается с решеткой MT и стабилизирует MT (Chan et al., 2005; Dougherty et al., 2005; Werner et al., 2014). У Xenopus laevis CLAMP ранее был вовлечен в апикальное накопление стабильных ацетилированных МТ, которые необходимы в процессе радиальной интеркаляции, посредством которой МКЦ и ионоциты подвергаются поляризованной миграции из внутреннего эпителиального слоя во внешний эпителий (Werner et al., 2014). Однако, помимо ассоциации с MTs, мы обнаружили, что существует значительное обогащение CLAMP на не-MT сайтах, включая корешки, связанные с подвижными ресничками и сайты апикальных межклеточных соединений (Fig. 1 A). Мы предполагаем, что этот соединительный пул CLAMP используется во многих формах клеточной полярности, модулируя стабильность и локализацию белка PCP. Кроме того, на функцию MT влияет передача сигналов PCP, и мы обнаруживаем множественные дефекты в MTs ниже по ходу передачи сигналов как CLAMP, так и PCP, что указывает на дополнительную, косвенную роль CLAMP в облегчении динамики MT.

Иммуноокрашивание с помощью CLAMP-специфических mAb указывает на то, что CLAMP слабо локализуется в сети MT и обогащается в местах повышенной концентрации MT (например, средние тела, центриоли и реснички; Werner et al., 2014). Важно, что CLAMP также обогащается на апикальной клеточной мембране в месте межклеточных контактов (Fig. 1 A). Чтобы проверить, является ли это обогащение на границах клеток специфическим, мы создали мозаичные эмбрионы, в которых клетки, отмеченные синим флуоресцентным белком, содержали ранее подтвержденный морфолино CLAMP (MO; Werner et al., 2014). Иммунофлуоресценция подтверждает, что окрашивание CLAMP в клетках морфанта CLAMP в значительной степени отсутствует (рис. 1, A и B). Мы количественно оценили эту потерю конкретно на клеточных контактах, оценив интенсивность флуоресценции CLAMP относительно маркера плотных контактов ZO-1 на апикальных соединениях и обнаружили> 90% снижение окрашивания CLAMP на границах MO – MO по сравнению с границами WT – WT (рис. . 1 В; P <0,0005). Что еще более важно, когда мы выполнили этот анализ между границами WT-MO, мы также увидели значительную потерю окрашивания CLAMP, что указывает на не клеточно-автономный эффект, когда потеря ассоциированного с мембраной CLAMP в одной клетке приводит к потере ассоциированного с мембраной ЗАЖИМ в своем соседе (рис.1 В; P <0,0005).

CLAMP ранее был вовлечен в радиальную интеркаляцию MCCs и ионоцитов, однако окрашивание антителами (Ab) показывает, что он экспрессируется во всех клетках эпителия. Высокая доза CLAMP MO (10 нг в каждом бластомере на стадии 4 клеток) вызывает раннюю эмбриональную летальность примерно на стадии 14 перед дифференцировкой MCC. В соответствии с этим наши попытки CRISPR-опосредованного редактирования генома также привели к полной потере жизнеспособности, что указывает на широкую роль CLAMP в развитии.Важно отметить, что прицельные инъекции МО в подмножество бластомеров (1 клетка на стадии 4) генерируют мозаичные эмбрионы, которые демонстрируют гораздо более высокую выживаемость и позволяют сравнивать клетки WT и морфантов в одном и том же эмбрионе (Werner and Mitchell, 2013). Фактически, мозаичные эмбрионы морфантов CLAMP часто обнаруживают в целом задержанный и изогнутый рост, напоминающий PCP-обусловленные дефекты конвергентного удлинения (Wallingford et al., 2002). Мы наблюдаем, что во время удлинения эмбриона (стадии 16–28) большинство митотических клеток выравнивают свои веретена вдоль передне-задней (A-P) оси с круговым SD (CSD) 27 ° (рис.1, В и Г). Подобно тому, что наблюдалось в др. Удлиняющихся тканях, мы наблюдаем, что ориентация веретена чувствительна к передаче сигналов PCP (Vichas and Zallen, 2011). Нарушение PCP с использованием ранее подтвержденного Vangl2 MO приводит к значительному увеличению CSD по сравнению с контролем (Fig. 1 D; CSD, 38 °; P <0,005; Mitchell et al., 2009). В соответствии с тем, что CLAMP играет роль в передаче сигналов PCP, мы также наблюдаем, что истощение CLAMP приводит к аналогичному дефекту в ориентации веретена (Рис. 1 D; CSD, 48 °; P <0.00005).

В MCCs, которые правильно поляризованы, реснички бьются в заднем направлении, что отражается в их поперечно-полосатых корешках, выступающих в переднем направлении (Park et al., 2008). Частичное истощение CLAMP с использованием 5 нг MO в одном из четырех бластомеров приводит к фенотипу, при котором значительное количество MCCs удается правильно интеркалировать, что позволяет нам оценивать полярность ресничек. Мы определили полярность в этих клетках, оценив положение корешков (отмеченных Mig12-GFP) и связанных с ними базальных тел (отмеченных Centrin-RFP) относительно оси A-P (рис.2; Park et al., 2008). Мы наблюдаем два различных дефекта полярности. Во-первых, наблюдается значительная потеря координации полярности ресничек внутри клеток (фиг. 2, A и B; и фиг. 1 C, длина стрелки; средняя длина вектора 0,82 в контроле против 0,38 у морфантов CLAMP). Количественная оценка этого фенотипа показывает увеличение CSD на 83,8 ° для морфантов CLAMP по сравнению с 35,1 ° для контрольных морфантов (P <0,0005). Это похоже на то, что сообщалось для клеток, обработанных деполимеризующим МТ лекарственным средством нокодазолом, что согласуется с идеей, что CLAMP необходим для регуляции стабильности МТ во время установления полярности ресничек (Werner et al., 2011). Кроме того, мы также наблюдаем рандомизацию в средней ориентации ресничек, которая использовалась в качестве прокси для клеточной полярности (Fig. 2C, direction of arrow; Werner and Mitchell, 2012). Фактически, потеря средней ориентации ресничек ранее была связана с дефектами передачи сигналов PCP в соответствии с CLAMP, влияющим на путь PCP (Park et al., 2008; Mitchell et al., 2009; Guirao et al., 2010; Vladar et al. ., 2012; Бутин и др., 2014).

Чтобы устранить возможность того, что наблюдаемые дефекты полярности являются результатом тонких дефектов интеркаляции МКЦ, мы обошли дефекты интеркаляции путем преобразования наружных эпителиальных клеток (ОК) в МКЦ с использованием фактора дифференцировки МКЦ Multicilin (или MCIDAS; Stubbs et al., 2012). В эктопических МКЦ, инъецированных контрольным МО, полярность хорошо установлена ​​(рис. 2, D и F; средний вектор 0,66; CSD 51,5 °). Напротив, когда эктопические МКЦ были истощены по CLAMP (10 нг на один бластомер), мы обнаружили серьезную потерю как направленности, так и координации (рис.2, E и F; средний вектор 0,19; CSD 108,4 °; P <0,0005). ). В совокупности эти результаты подтверждают, что CLAMP необходим для правильного PCP-зависимого установления полярности ресничек.

При правильной поляризации эпителиальные клетки обнаруживают асимметричное накопление ядер PCP белков (Goodrich and Strutt, 2011).Комплекс трансмембранного белка Frizzled (Fz) с Disheveled (Dvl) локализуется на одной стороне клетки, тогда как комплекс трансмембранного белка Strabismus / Van Gogh (Vangl) вместе с Prickle (Pk) располагается на другой стороне. Эти асимметричные комплексы как стабилизируются, так и усиливаются за счет взаимодействий с членами семейства Flamingo / Celsr трансмембранных атипичных кадгеринов (Strutt et al., 2016). В Xenopus асимметрия PCP проиллюстрирована накоплением GFP-меченного Pk2 в апикальной клеточной коре на задних границах клеток и GFP-меченного Dvl1 на передних границах (рис.3, A, C, F – H и J; и Рис. S1 A; Батлер и Уоллингфорд, 2015). Чтобы проверить гипотезу о том, что CLAMP действует в установлении PCP, мы измерили интенсивность флуоресценции на передней и задней границе клеток GFP-Pk2- и Dvl1-GFP-экспрессирующих клеток и обнаружили, что асимметричное накопление этих белков теряется в клетках морфанта CLAMP ( Рис. 3, B, F, I и J и Рис. S1, A – C). Интересно, что мы не наблюдаем потери или изменения окрашивания CLAMP в Vangl2-дефицитных клетках (рис. S1, E и F).Следовательно, хотя CLAMP регулирует передачу сигналов PCP посредством локализации асимметричных компонентов PCP, обратное, по-видимому, неверно, предполагая, что CLAMP находится выше передачи сигналов PCP.

Отличительным признаком передачи сигналов PCP являются не автономные клетки дефекты, которые распространяются, когда молекулы PCP разрушаются. Мы протестировали не-клеточно-автономный эффект с использованием мозаичных тканей, экспрессирующих GFP-Pk2, в которых часть клеток была лишена CLAMP (отмечена mem-RFP).В изолированных клетках морфантов (клеточно-автономные Рис. 3, B и F), а также в клетках WT, окруженных тканью морфантов (не клеточно-автономных; Рис. 3, D и G), не удается локализовать Pk2 асимметрично. Этот не-клеточно-автономный эффект является двунаправленным, поскольку мы наблюдаем дефекты Pk2 в клетках, граничащих с морфатами CLAMP либо на задней, либо на передней стороне (Fig. S1 D). Важно отметить, что мы также обнаруживаем CLAMP-опосредованные дефекты PCP как в MCC, так и в OC, что позволяет предположить, что CLAMP широко используется для установления и передачи сигналов PCP (рис.S1, A – C). CLAMP располагается симметрично вокруг коры клетки, а истощение CLAMP вызывает двунаправленную потерю CLAMP и правильную передачу сигналов PCP в соседних клетках. Эти результаты подтверждают, что CLAMP может модулировать межклеточные взаимодействия, которые облегчают передачу сигналов PCP. Celsrs образуют комплексы как с Fz-Dvl на одной стороне клетки, так и с Vangl-Pk на другой и действуют, чтобы скоординированно стабилизировать двунаправленную передачу сигналов PCP (Tissir and Goffinet, 2013; Strutt et al., 2016). Используя ранее опубликованное Xenopus Celsr2 Ab (Cha et al., 2011), мы протестировали влияние истощения CLAMP на локализацию Celsr2. Истощение CLAMP приводит к значительной потере Celsr2 в клетках морфантов (Fig. 4; WT – WT vs. MO – MO; P <0,0005). Важно, что истощение CLAMP не оказывает не-клеточно-автономного эффекта на Celsr2 в соседних клетках, указывая тем самым, что не-клеточно-автономная потеря CLAMP не опосредуется строго через Celsr2 (Fig. 4, B and C). Для дальнейшего изучения этого мы создали МО Celsr2 и обнаружили, что истощение Celsr2 привело к ожидаемому истощению Ceslr2 на мембранах между МО-МО клетками (vs.WT – WT; P <0,0005) и частичное истощение между клетками WT – MO (рис. S2, A – C; по сравнению с WT – WT; P <0,05). Напротив, истощение Ceslr2 не влияет на локализацию CLAMP, дополнительно подтверждая, что функция CLAMP находится выше передачи сигналов Celsr2 и PCP (Fig. S2, D-F). В эпендимных клетках мыши Celsr1-3 выполняет различные роли полярности, которые в совокупности способствуют правильной поляризации MCC с Celsr1, управляя координацией на тканевом уровне, и Celsr2 и 3, управляя координацией ресничек (Boutin et al., 2014). Хотя наш анализ сосредоточен на Celsr2, истощение CLAMP влияет на многие аспекты полярности, предполагая, что оно может аналогичным образом влиять на других членов семейства Celsr.

CLAMP связывает и стабилизирует MTs, предполагая, что механизм модуляции передачи сигналов PCP может быть опосредован через MT. Альтернативно, CLAMP может регулировать асимметрию PCP, которая, в свою очередь, может регулировать функцию MT. Фактически известно, что MT действуют как перед передачей сигналов PCP, облегчая асимметричное накопление компонентов PCP, так и ниже по ходу передачи сигналов PCP, накапливая асимметрично PCP-зависимым образом (Shimada et al., 2006; Владар и др., 2012). В трахеальных и эпендимных MCC мышей лечение нокодазолом приводит к потере асимметрии белка PCP (Vladar et al., 2012; Boutin et al., 2014). Важно отметить, что обработка эмбрионов Xenopus между стадиями 20 и 28 с использованием дозы нокодазола, которая останавливает формирование собственно ресничек, не приводит к количественным изменениям в накоплении мембран Celsr2 (Fig. S3, A – C). Мы интерпретируем этот результат как указание на функцию CLAMP на мембране, которая отличается от его роли в стабилизации MT.Однако критическое окно образования PCP неизвестно, и продолжающееся развитие эмбрионов в наших экспериментах указывает на то, что динамика MT не отменяется полностью, оставляя открытой возможность того, что MTs потенциально могут играть роль в CLAMP-обеспечиваемой локализации Celsr2.

У Xenopus MTs образуют плотную апикальную сеть, соединяющую десятки базальных тел в MCCs (Werner et al., 2011). Используя MT-связывающий домен энсконсина, слитый с GFP (EMTB-3xGFP) в качестве заместителя для MT, мы наблюдаем, что эта апикальная сеть MT находится в непосредственной близости от клеточной мембраны на задней границе клетки и что существует небольшой, но воспроизводимый разрыв на передней границе клетки (рис.5 А). Мы количественно оценили этот фенотип, измеряя интенсивность флуоресценции EMTB-3xGFP в пределах 1 мкм от клеточной мембраны на задней и передней стороне клетки на уровне базальных тел (рис. 5, D и E). Заднее обогащение, наблюдаемое у контрольных морфантов, теряется в клетках морфантов CLAMP, и в большинстве этих клеток сеть MT равномерно организуется вокруг клеточной мембраны (Fig. 5, B and E). Учитывая обратную связь между путем PCP и MT, этот фенотип может быть либо выше, либо ниже передачи сигналов PCP.Чтобы проверить это, мы количественно оценили EMTB-3xGFP у морфантов Vangl2 и обнаружили сходную потерю асимметрии MT, предполагая, что этот фенотип находится ниже по течению функции как CLAMP, так и PCP (Fig. 5, C and E). В соответствии с этим, мы видим эту асимметрию только в зрелых МКЦ, которые завершили поляризацию (например, стадия 28).

MT по своей природе поляризованы с преимущественно стабильным (-) концом и динамическим (+) концом. Мы создали слияние GFP с концевым белком MT (-) CAMSAP2 (CAMSAP2-GFP) и обнаружили, что в ОК, CAMSAP2 локализован, чтобы пунктировать очаги по всей клетке (рис.S3 D, стрелки; Хендершотт и Вейл, 2014; Jiang et al., 2014). Напротив, имеется сильное преимущественное накопление CAMSAP2 в филаментах по всей задней стороне MCCs (Fig. 5, F and F ‘; and Fig. S3 D). Чтобы количественно оценить этот фенотип, мы создали конфокальные стеки CAMSAP2-GFP, измерили интенсивность флуоресценции на каждой стороне клетки и обнаружили значительное заднее обогащение CAMSAP2 в контрольных клетках, которое полностью исчезло в клетках морфанта CLAMP (рис. -Я). Контраст фенотипов очевиден в мозаичных тканях, в которых клетки WT можно увидеть в непосредственной близости от морфанта CLAMP, отмеченного синим декстраном (рис.5 G). Важно отметить, что мы не наблюдаем какого-либо обогащения CLAMP на МТ, меченных CAMSAP2. Более того, этот пул MTs отличается от сети MTs, связывающих базальные тельца с клеточной корой, поскольку он обогащен по всей задней стороне клетки, а не только в апикальной коре (Fig. 5 F ‘, side projection). Кроме того, подобно данным EMTB, мы наблюдаем асимметрию CAMSAP2 только в MCCs, которые уже установили клеточную полярность (например, стадия 28), предполагая, что она находится ниже по ходу передачи сигналов PCP.Чтобы обратиться к этой гипотезе, мы протестировали локализацию CAMSAP2 у морфантов Vangl2 и обнаружили потерю асимметрии, сходную с истощением CLAMP (Fig. 5 I and Fig. S3 E). В отличие от (+) концевых маркеров, которые ограничены кончиком роста, CAMSAP2 украшает часть решетки микротрубочек на (-) части MT, а не только (-) кончик (Hendershott and Vale, 2014; Jiang et al. , 2014). Таким образом, локализация CAMSAP2 выявляет отдельную стабильную подгруппу сети MT, которая, по-видимому, проходит вдоль задней клеточной мембраны в зависимости от CLAMP-опосредованного PCP.В совокупности эти данные предполагают, что CLAMP способствует асимметричному распределению как мембранно-ассоциированных белков PCP, так и стабильной субпопуляции сети MT, которая асимметрично расположена в цитоплазме.

CLAMP ранее был вовлечен в асимметричное накопление стабильных MT во время радиальной интеркаляции, где он способствует направленным движениям MCC и ионоцитов во внешний эпителий.Здесь мы определяем новую роль CLAMP в продвижении PCP, предполагая, что CLAMP широко используется для облегчения множественных форм клеточной полярности. В целом, наши результаты указывают на CLAMP как на новый регулятор передачи сигналов PCP. Мы предполагаем, что CLAMP облегчает межклеточную коммуникацию, на что указывает его роль в локализации Celsr2, которая, в свою очередь, способствует образованию асимметричных белковых комплексов PCP. Асимметричное накопление дифференциальных комплексов PCP на противоположных сторонах клетки — это сложный процесс, который, как предполагалось, требует дифференциального переноса, дифференциальной стабилизации соединений, дифференциального рециклинга эндоцитов и конкурентных белковых взаимодействий, которые асимметрично влияют на эти процессы (Butler and Wallingford, 2017). .Фактически, хотя Celsr формирует гомофильные взаимодействия с другими молекулами Celsr, он предпочтительно стабилизирует эти взаимодействия, если они происходят между комплексами Celsr-Fz-Dvl и Celsr-Vangl-Pk (Strutt and Strutt, 2008). Интересно, что у морфанта CLAMP мы видим, что клетки Pk2 накапливаются симметрично вокруг клеточной коры (Fig. 3 B). Напротив, хотя Dvl1 также распределяется симметрично, мы наблюдаем значительную потерю Dvl1 на мембране, что позволяет предположить, что Dvl1 либо неправильно транспортируется в кортекс, либо подвергается несоответствующему эндоцитозу (рис.3 I).

Конечно любопытно, что у мозаичных морфантов CLAMP, соединительный CLAMP теряется из соседних клеток WT, тогда как Celsr2 остается. Частичное истощение Celsr2 на границах Celsr2 MO – WT (рис. S2 C) по сравнению с нормальными уровнями Ceslr2 на границах CLAMP MO – WT (рис. 4) предполагает, что эффект CLAMP не строго связан с модуляцией уровней белка Celsr2, но, скорее всего, отражает функция в модулировании дифференциальных комплексов Цельсра.Будущие работы потребуются, чтобы определить, функционирует ли CLAMP для дифференциальной модуляции трафика или эндоцитоза или он специфически стабилизирует определенные соединительные комплексы PCP.

эмбрионов фиксировали либо в 4% PFA в PBS в течение 2 часов, либо в 100% метаноле в течение 48 часов при -20 ° C (требуется для анти-CLAMP; Werner and Mitchell, 2013; Zhang and Mitchell, 2015). В качестве АТ использовались анти-ZO-1 (61–7300; Thermo), анти-CLAMP (Werner et al., 2014), анти-CELSR2 (Cha et al., 2011) и вторичные антитела, конъюгированные с Cy-2–, Cy-3– или Cy-5 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc.). Celsr2 Ab, который мы использовали, был подарком от S.W. Cha (Детская больница Цинциннати, Цинциннати, Огайо), которая была ранее опубликована (Cha et al., 2011). Однако в этой публикации Celsr2 неправильно назывался Celsr1. Последовательности, использованные для проверки специфичности Ab, были GCAGCAACTCAGGATGTTCA и TTTATTCCACGCAGGGTCTC, оба из которых соответствуют Celsr2 (Cha et al., 2011). Кроме того, мы генерировали как MO Celsr1, так и Celsr2, но наблюдали потерю окрашивания Ab только у эмбрионов Celsr2 MO. Для визуализации актина мы использовали фаллоидин 568 или 647 (Invitrogen) GFP-PK2, а данные Dvl1-GFP были получены на живых эмбрионах (Butler and Wallingford, 2015). Конфокальные изображения были получены с использованием программного обеспечения Nikon Elements на микроскопе Nikon A1R с масляным объективом 60 × Plan / Apo, 1,4 NA. Получение изображений в реальном времени и на фиксированных изображениях выполняли при комнатной температуре в 0,1 × модифицированных моделях Рингера по Марку для живых изображений или во фторгеле для фиксированных изображений (электронная микроскопия).Количественная оценка ориентации корешка, формы клеток и полярности клеток проводилась вручную с использованием программного обеспечения Nikon Elements. Oriana2 использовалась для всей круговой статистики и построения графиков. Количественная оценка интенсивности флуоресценции была выполнена, как описано в условных обозначениях, с использованием программного обеспечения Nikon Elements (рис. 1 B; рис. 2, F, G и J; рис. 4 C; рис. S1, C, D и F; рис. S2. D; и рис. S3 C) или с помощью ImageJ (рис. 5, E и I; и рис. S2 C). Вкратце, измерения интенсивности проводились на клеточной мембране, маркированной фаллоидином, mem-RFP или ZO-1 (рис.1 В; Рис. 3, F, G и J; Рис. 4 C; Рис. S1, C и D; и фиг. S3 C) в пределах 1 мкм от клеточной мембраны (фиг. 5 E) или внутри всей половины клетки (фиг. 5 I). Графики локализации (рис. 3, F, G и J; рис. 5, E и I; и рис. S1, C и D) были построены с помощью GraphPad из значения log2 задней интенсивности / передней интенсивности, как показано на рисунках ( Рис.3, Рис.5 и Рис. S1; Butler, Wallingford, 2015). Excel (Microsoft) использовался для некруговой статистики и гистограмм. На гистограммах (рис.1, Б и Г; Рис. 4 C; Рис. S1 F; Рис S2, C и D; и рис. S3 C), полосы ошибок представляют SD, а значения p были рассчитаны с использованием двусторонних тестов типа 2 t . Распределение данных предполагалось нормальным, но формально это не проверялось.