Меню Закрыть

G93: Код диагноза G93 — Другие поражения головного мозга

Содержание

G93.2 Ликворная гипертензия у детей

жалобы по диагнозу

  • Беспокойство ребенка
  • Срыгивания
  • Рвота

    извержение желудочного и кишечного содержимого через рот и носовые ходы

  • Мозговой плач ребёнка

    Плач непрекращающийся, громкий, на одной ноте,часто переходящий в стон.

  • Судорожные проявления

симптомы по диагнозу

  • Выбухание большого родничка
  • ЭкзофтальмЭкзофтальм — смещение глазного яблока вперёд, в некоторых случаях со смещением в сторону.
  • Рвота
  • Увеличение окружности головы более чем на 2см
  • Изменения в нейросонограмме
  • Грефе симптом IIпризнак сифилитического или врожденного паралича мышц радужной оболочки: в положении сильного отведения глаз зрачки после некоторого скрытого периода суживаются и на свет не реагируют
  • Мышечная дистонияНарушение мышечного тонуса.

краткое описание диагноза

Ликворная гипертензия у детей

Гидроцефалия (ликворная гипертензия)— это неуклонно прогрессирующее состояние, вызываемое различными причинами, проявляющееся аномальным увеличением ликворных пространств мозга, в первую очередь его желудочков, и повышенным внутричерепным давлением..
Повышенное внутричерепное давление у грудничков является следствием гипоксии (недостатка кислорода) или инфекций, перенесенных ими в период своей внутриутробной жизни, травм шейного отдела позвоночника, приобретенных во время рождения, либо генетических аномалий в строении головного мозга.
Наличие внутричерепной гипертензии у грудничков, в том числе и у новорожденных детей, можно заподозрить при увеличении размеров головы, двигательном беспокойстве, частых срыгиваниях, не связанных с приемом пищи, трудностях засыпания или, наоборот, сонливости.

самопомощь при диагнозе

Заниматься самолечением не желательно.Своевременная постановка диагноза приводит к более раннему и полному выздоровлению ребёнка. 

режим лечения

Амбулаторно-стационарный

МКБ-10 код G93.5 | Сдавление головного мозга

ICD-10

ICD-10 is the 10th revision of the International Statistical Classification of Diseases and Related Health Problems (ICD), a medical classification list by the World Health Organization (WHO).

It contains codes for diseases, signs and symptoms, abnormal findings, complaints, social circumstances, and external causes of injury or diseases.

ATC

The Anatomical Therapeutic Chemical (ATC) Classification System is used for the classification of active ingredients of drugs according to the organ or system on which they act and their therapeutic, pharmacological and chemical properties.

It is controlled by the World Health Organization Collaborating Centre for Drug Statistics Methodology (WHOCC).

DDD

The defined daily dose (DDD) is a statistical measure of drug consumption, defined by the World Health Organization (WHO).

It is used to standardize the comparison of drug usage between different drugs or between different health care environments.

G93.6 — Отек мозга — список препаратов нозологической группы в справочнике МКБ-10

L-лизина эсцинат®

Конц. д/пригот. р-ра д/в/в введения 1 мг/мл: амп. 5 мл 10 шт.

рег. №: ЛП-000504 от 01.03.11 Дата перерегистрации: 04.10.19
Гидрокортизон

Сусп. д/в/м и внутрисуставного введения 25 мг/1 мл: амп. 5 или 10 шт.

рег. №: П N016113/01 от 16.10.09
Гидрокортизон

Сусп. д/в/м и внутрисуставного введения 50 мг/2 мл: амп. 5 или 10 шт.

рег. №: П N016113/01 от 16.10.09
Дексазон

Р-р д/инъекц. 4 мг/1 мл: амп. 5 шт.

рег. №: П N014411/02-2002 от 26.05.10
Дексазон

Таб. 500 мкг: 50 шт.

рег. №: П N014411/01-2002 от 24.05.10
Дексамед

Р-р д/в/в и в/м введен. 4 мг/1 мл: амп. 100 шт.

рег. №: П N015488/01 от 15.12.08
Дексамед

Р-р д/в/в и в/м введен. 8 мг/2 мл: амп. 100 шт.

рег. №: П N015488/01 от 15.12.08
Дексаметазон

Р-р д/в/в и в/м введен. 4 мг/1 мл: амп. 5 или 10 шт.

рег. №: ЛСР-002011/09 от 17.03.09
Дексаметазон

Р-р д/инъекц. 4 мг/1 мл: амп. 25 шт.

рег. №: П N012237/02 от 28.04.11 Дата перерегистрации: 02.04.19
Произведено и расфасовано: KRKA (Словения)
Дексаметазон

Р-р д/инъекц. 4 мг/1 мл: амп. 5 или 10 шт.

рег. №: ЛСР-002125/08 от 27.03.08
Дексаметазон

Р-р д/инъекц. 4 мг/1 мл: амп. 5 или 10 шт.

рег. №: ЛП-001203 от 11.11.11
Дексаметазон

Р-р д/инъекц. 4 мг/1 мл: амп. 5 или 25 шт.

рег. №: П N014597/01 от 01.06.10
Дексаметазон

Р-р д/инъекц. 4 мг/мл: 1 мл амп. 5 или 10 шт.

рег. №: ЛП-002634 от 22.09.14
Дексаметазон

Р-р д/инъекц. 4 мг/мл: 1 мл или 2 мл амп. 5 или 10 шт.

рег. №: ЛП-000682 от 28.09.11
Дексаметазон

Р-р д/инъекц. 4 мг/мл: амп. 1 мл или 2 мл 5, 10, 15, 20, 25 мл

рег. №: ЛП-003438 от 02.02.16
Дексаметазон

Р-р д/инъекц. 4 мг/мл: амп. 25 шт.

рег. №: ЛП-001249 от 21.11.11
Дексаметазон

Р-р д/инъекц. 4 мг/мл: амп. или фл. 1 мл или 2 мл

рег. №: ЛП-001018 от 18.10.11
Дексаметазон

Р-р д/инъекц. 8 мг/2 мл: амп. 5 или 10 шт.

рег. №: ЛСР-002125/08 от 27.03.08
Дексаметазон

Р-р д/инъекц. 8 мг/2 мл: амп. 5 или 25 шт.

рег. №: П N014597/01 от 01.06.10
Дексаметазон

Р-р д/инъекц. 4 мг/1 мл: амп. 5, 10, 20, 25 или 25 шт.

рег. №: П N014442/01-2002 от 18.11.08

Р-р д/инъекц. 8 мг/2 мл: амп. 5, 10, 15, 20 или 25 шт.

рег. №: П N014442/01-2002 от 18.11.08
Дексаметазон

Таб. 0.5 мг: 10 или 50 шт.

рег. №: ЛП-000882 от 18.10.11
Дексаметазон

Таб. 500 мкг: 10, 20, 50 или 100 шт.

рег. №: Р N002537/01 от 14.07.08
Дексаметазон

Таб. 500 мкг: 50 шт.

рег. №: П N016061/01 от 24.09.09
Дексаметазон-Виал

Р-р д/инъекц. 4 мг/1 мл: амп. 5 или 10 шт.

рег. №: ЛСР-006923/10 от 21.07.10
Упаковано: ОЗОН (Россия)
Дексаметазон-КРКА

Таб. 4 мг: 10, 20, 30, 50, 60 или 100 шт.

рег. №: ЛП-006755 от 05.02.21

Таб. 8 мг: 10, 20, 30, 50, 60 или 100 шт.

рег. №: ЛП-006755 от 05.02.21
Дексаметазон-Ферейн

Р-р д/инъекц. 4 мг/1 мл: амп. 5, 10 или 25 шт.

рег. №: Р N003045/01 от 15.08.08
Дексаметазон-Ферейн

Р-р д/инъекц. 8 мг/2 мл: амп. 5, 10 или 25 шт.

рег. №: Р N003045/01 от 15.08.08
Гидрокортизона ацетата суспензия для инъекций 2.5%

Сусп. д/в/м и внутрисуставного введения 25 мг/1 мл: амп. 10 или 25 шт.

рег. №: 83/1252/7 от 28.10.83
Гидрокортизона ацетата суспензия для инъекций 2.5%

Сусп. д/в/м и внутрисуставного введения 25 мг/1 мл: амп. 10 или 25 шт.

рег. №: 83/1252/7 от 28.10.83
Гидрокортизона ацетата суспензия для инъекций 2.5%

Сусп. д/в/м и внутрисуставного введения 50 мг/2 мл: амп. 10 или 25 шт.

рег. №: 83/1252/7 от 28.10.83
Гидрокортизона ацетата суспензия для инъекций 2.5%

Сусп. д/в/м и внутрисуставного введения 50 мг/2 мл: амп. 10 или 25 шт.

рег. №: 83/1252/7 от 28.10.83
Дексавен

Р-р д/инъекц. 4 мг/1 мл: амп. 10 шт.

рег. №: П N014016/01-2002 от 23.05.02
Дексавен

Р-р д/инъекц. 8 мг/2 мл: амп. 10 шт.

рег. №: П N014016/01-2002 от 23.05.02
Дексакорт

Капли глазные и ушные 0.1%: фл-капельн. 5 мл

рег. №: П N013896/01-2002 от 23.04.02
Дексаметазон

Р-р д/инъекц. 4 мг/1 мл: амп. 5 или 10 шт.

рег. №: Р N002693/01 от 25.06.08
Дексаметазон

Р-р д/инъекц. 8 мг/2 мл: амп. 5 или 10 шт.

рег. №: Р N002693/01 от 25.06.08
Дексаметазона таблетки 0.0005 г

Таб. 500 мкг: 10, 20, 30, 40, 50 или 100 шт.

рег. №: 70/421/6 от 25.06.70
Дексаметазона таблетки 0.0005 г

Таб. 500 мкг: 10, 20, 30, 40, 50 или 100 шт.

рег. №: 70/421/6 от 25.06.70
Дексаметазона таблетки 0.0005 г

Таб. 500 мкг: 10, 20, 30, 40, 50 или 100 шт.

рег. №: 70/421/6 от 25.06.70
Дексаметазона таблетки 0.0005 г

Таб. 500 мкг: 10, 20, 30, 40, 50 или 100 шт.

рег. №: 70/421/6 от 25.06.70

СВЕТОДИОДНАЯ ЛАМПА 13,5 — 100ВТ E27 GLOBE WW 230В G93 FR

СВЕТОДИОДНАЯ ЛАМПА 13,5 — 100ВТ E27 GLOBE WW 230В G93 FR — bauhof.ee

JavaScript seems to be disabled in your browser. For the best experience on our site, be sure to turn on Javascript in your browser.

9,90€ tk

Цена в онлайн-магазине

Специальные цены интернет-магазина могут отличаться от цен в обычных магазинах.

Общая информация

Производитель Philips
Код производителя 929001179801
Код товара 594928

Размеры упаковки

Вес нетто 0.25 кг
Высота упаковки 16.1 см
Длина упаковки 9.6 см
Ширина упаковки 9.6 см
Вес 0.25 кг

Уважаемый клиент, просим учитывать, что отображается реальное состояние на складе магазина в конкретный магазин, и оно может меняться с течением времени. NB! образцы продукции также показаны на складе

Клуб мастеров цена

При покупке в интернет-магазине Bauhof на сумму больше 400€ транспорт начиная с 5€ (не относится к доставке крупногабаритных товаров и доставке  товаров на поддонах).

Транспортная услуга «товар со склада»

Ориентировочный срок получения отмечен на карточке товара. При поступлении торвара на склад Вам пришлют уведомление.

product

https://www.bauhof.ee/ru/dom-i-inter-er/svetodiodnaja-lampa-13-5-100vt-e27-globe-ww-230v-g93-fr-594928 4343018 СВЕТОДИОДНАЯ ЛАМПА 13,5 — 100ВТ E27 GLOBE WW 230В G93 FR https://www.bauhof.ee/media/catalog/product/5/9/594928_E1.jpg 9.90 16.39 EUR OutOfStock /Все товары/Дом и интерьер /Все товары/Дом и интерьер/Освещение /Все товары/Дом и интерьер/Освещение/Источники света /Все товары/Освещение /Все товары/Освещение/Источники света /Все товары/Освещение/Источники света/Светодиодные лампы add-to-cart low-stock 1 tk 44% 9,90

Товар добавлен в список покупок

Для добавления товара в список покупок войдите, пожалуйста, в систему.

Bauhof.ee лучше всего работает с двумя последними версиями современных браузеров. Для более удобного и быстрого использования мы рекомендуем обновить браузер: Internet Explorer, Mozilla Firefox, Chrome, Safari.

РЕЖИМ СКОРОСТИ ПОДАЧИ (G93, G94 И G95)

РЕЖИМ СКОРОСТИ ПОДАЧИ (G93, G94 И G95)

Чтобы установить режим активной подачи на обратное время, запрограммируйте: G93

Обратное время используется для программирования одновременного скоординированного линейного и скоординированного вращательного движения. В режиме обратнозависимой скорости подачи слово F означает, что перемещение должно быть завершено за [число 1 / F] минут.

ПРИМЕР — Если число F равно 2,0, ход должен быть завершен за полминуты.

Когда активен режим обратнозависимой скорости подачи, слово F должно появляться в каждой строке, которая имеет движение G01 , G02 или G03 , и слово F в строке, в которой нет G01 , G02 или G03 игнорируется. Режим подачи с обратнозависимой скоростью не влияет на движения G00 (ускоренный ход).

Чтобы установить активный режим подачи в режим единиц в минуту, запрограммируйте: G94

В режиме скорости подачи единиц в минуту слово F интерпретируется как означающее, что контролируемая точка должна двигаться со скоростью определенное количество дюймов в минуту или миллиметров в минуту, в зависимости от того, какие единицы длины используются.

Чтобы установить активный режим подачи в режим единиц на оборот, запрограммируйте: G95

В режиме единиц на оборот слово F интерпретируется как означающее, что контролируемая точка должна перемещаться на определенное количество дюймов за один оборот шпинделя, в зависимости от того, какие единицы длины используются. G95 не подходит для нарезания резьбы, для нарезания резьбы используйте G33 или G76.

УСТРАНЕНИЕ НЕПОЛАДОК

Это ошибка, если:

  • Режим обратной скорости подачи активен, и в строке с G01 , G02 или G03 (явно или неявно) нет слова F
  • Новая скорость подачи не указана после переключения на G94 или G95 Уровень возврата постоянного цикла — G98 и G99

DLL3 (G93) Антитело

Ограниченное использование

Если иное прямо не согласовано в письменной форме, подписанной законным представителем CST, следующие условия: применяются к Продуктам, предоставляемым CST, ее аффилированными лицами или ее дистрибьюторами.Любые условия и положения Клиента, которые находятся в дополняют или отличаются от содержащихся в настоящем документе, если иное не принято в письменной форме юридически уполномоченным представитель CST, отклоняются и не имеют силы.

Продукты имеют маркировку «Только для исследовательских целей» или аналогичное заявление о маркировке и не были одобрены, одобрены или лицензированы. FDA или другой регулирующей иностранной или отечественной организацией для любых целей. Заказчик не должен использовать какой-либо Продукт для диагностики. или в терапевтических целях, или иным образом любым способом, который противоречит заявлению на этикетке.Продукты, продаваемые или лицензируемые CST предоставляются Заказчику как конечному пользователю и исключительно для использования в исследованиях и разработках. Любое использование Продукта для диагностики, в профилактических или терапевтических целях, или любая покупка Продукта для перепродажи (отдельно или в качестве компонента) или в других коммерческих целях, требуется отдельная лицензия от CST. Клиент обязуется (а) не продавать, лицензировать, ссужать, жертвовать или иным образом передавать или предоставлять любой Продукт для любой третьей стороны, отдельно или в сочетании с другими материалами, или использовать Продукты для производства любых коммерческие продукты, (б) не копировать, изменять, реконструировать, декомпилировать, дизассемблировать или иным образом пытаться обнаружить лежащие в основе структуру или технологию Продуктов, или использовать Продукты с целью разработки любых продуктов или услуг, которые конкурировать с продуктами или услугами CST, (c) не изменять и не удалять из Продуктов какие-либо товарные знаки, торговые наименования, логотипы, патенты или уведомления об авторских правах или маркировка, (d) использовать Продукты исключительно в соответствии с Условия продажи продуктов CST и любые применимые документации, и (e) соблюдать любую лицензию, условия обслуживания или аналогичное соглашение в отношении любых сторонних продуктов или услуги, используемые Клиентом в связи с Продуктами.

G93 ἀδικία — Греческий лексикон Стронга

25 случаев использования G93 ἀδικία

Четкое употребление

5 несправедливость
4 несправедливость
3 несправедливость,
3
3 несправедливости;
2 несправедливости.
2 несправедливости
1 несправедливости
1 несправедливости;
1 несправедливости,
1 несправедливости
1 несправедливости:
1 несправедливости.»

Соответствующие слова на иврите

adikia H57 avel
adikia H57 avel
adikia h285 avvah
adikia H817 asham
adikia h2004 bet hammeri
adikia h2215 betsa
zikia h2345 adikia h2215 zikia h2341 zikia h234
adikia h3403 chattat
adikia h3555 chamas
adikia h5297 mutteh
adikia h5604 maal
adikia h5639 maaseh
adikia h5642 maashaqqot
adikia h5820 mirmah
avikahia h5751.
adikia * H5753 avayya
adikia H5766 avlah
adikia H5766 avval
adikia H5771 avon
adikia H5930 olah
adikia H6041 ani
adikia * H6230 eseq
adikia H621763 adikia h621763 osheqia
adikia H621763 adikia
3 adikia h621763 osheqia
adikia H7200 raah
adikia H7379 riv
adikia H7451 ra
adikia H7562 resha
adikia H7563 rasha
adikia H8267 sheqer


Родственные слова

G93 ἀδικία

G94 ἄδικος

ἄδικος
адикос
ad’-ee-kos
От G1 (как отрицательная частица) и G1349; несправедливый ; по расширению злой ; по смыслу вероломных ; конкретно язычников

KJV Использование: несправедливый, неправедный.


G91 ἀδικέωἀδικέω
адикеō
ад-ее-кех’-о
от G94; на быть несправедливо , то есть (активно) делать неправильно (морально, социально или физически)

KJV Использование: причинять боль, травмировать, быть обидчиком, быть несправедливым, (делать, страдать, принимать) неправильно .


G95 ἀδίκωςἀδίκως
адикс
ad-ee’-koce
Наречие из G94; несправедливо

KJV Использование: неправомерно.


Время обработки или скорость подачи (G93 / G94 / G95 / G194)

]>

Время обработки или скорость подачи (G93 / G94 / G95 / G194)

812_start

G93 Время обработки в сек.(модальный)

G94 Подача мм / мин (модальный, по умолчанию)

G95 Подача мм / оборот (модальный)

G194 Расчет подачи на основе взвешенная

макс. Оси корма (модальные)

Использование G-функций G93, G94, G95 и G194 действие F-слова может быть изменено по желанию:

Общие размеры для G94: F-слово для осей вращения (град./ мин)

F-слово для линейного оси (мм / мин)

G194 в сочетании со словом F определяет весовой коэффициент в [%] для максимально допустимых скоростей подачи. Этот максимум допустимая скорость подачи на траектории тогда определяется конкретные значения осей [2] -17. По крайней мере, одна ось затем движется с максимальной взвешенной скоростью. Только взвешивание допустимы коэффициенты меньше 100%.

Пример программирования

N10 G90 F1000 X100 (подача 1000 мм / мин (G94 Дефолт))

N20 G194 F90 (90% макс.ось скорость подачи)

Nxx X200 (подача, например, 9000 мм / мин с vb_max = 10000 мм / мин)

N80 G94 X50 (Подача 1000 мм / мин действительна с N10)

Nxx X .. Y .. Z .. (Интерполяция)

N120 G93 F20 (Время обработки 20 s)

Nxx X .. Y.. Z .. (Интерполяция)

N160 G94 F1500 X150 (подача 1500 мм / мин)

Nxx X .. Y .. Z .. (Интерполяция)

N200 M30

Если есть линейные и поворотные оси в траектории пути, которые совместно интерполируются, то для обеих осей типы F-слово имеет тот же размер, когда выбрано G93.

Если время обработки превышено из-за значений параметров и геометрии блока, то появляется сообщение об ошибке выход.

Функция G95 описана в глава 14.2.4.3.

812_end

Склонность к агрегации супероксиддисмутазы G93 мутантов «горячих точек» отражает клинические фенотипы БАС

Значимость

Мутации в человеческой супероксиддисмутазе Cu, Zn (СОД) вызывают болезнь двигательных нейронов БАС. Чтобы лучше понять, почему, мы сравнили агрегацию, связывание металлов и конформационную динамику нормальных и мутантных белков SOD, используя биофизические методы рассеяния рентгеновских лучей, МС с индуктивно связанной плазмой и спектроскопию ESR.Для белков SOD с дефектами в горячей точке мутации мы обнаружили, что дефицит меди, гибкость и агрегация параллельны клинической тяжести у пациентов с БАС. Эти данные подтверждают механизм дестабилизации объединяющего белкового каркаса для SOD-связанного БАС и, таким образом, указывают на потенциальные методы лечения этого летального состояния с несколькими вариантами лечения.

Abstract

Изменения белковой структуры наследственных мутантов Cu, Zn супероксиддисмутазы (SOD) вызывают неправильную сборку и агрегацию в клетках, пораженных болезнью двигательных нейронов БАС.Однако механистическая взаимосвязь между мутациями супероксиддисмутазы 1 ( SOD1 ) и заболеванием человека является спорной, и многие гипотезы предполагают склонность конкретных мутантов SOD вызывать БАС. Здесь мы экспериментально идентифицируем отличительные признаки мутантных белков SOD БАС, которые коррелируют с клинической тяжестью, применяя биофизические методы раствора к шести мутантам БАС в горячей точке человеческого SOD глицина 93. Анализ малоуглового рентгеновского рассеяния (SAXS) и другие структурные методы оценивались склонность к агрегации путем определения размера и формы фибриллярных агрегатов СОД после умеренных биохимических нарушений.МС с индуктивно связанной плазмой количественно определила стехиометрию связывания ионов металлов, а импульсная диполярная ЭПР-спектроскопия оценила сайт связывания Cu 2+ и определило кросс-димерное распределение расстояний между медью и медью. Важно отметить, что мы обнаружили, что дефицит меди у этих мутантов способствует агрегации, что полностью соответствует их клинической тяжести. Мутанты G93, по-видимому, правильно включают ионы металлов в физиологических условиях при помощи шаперона меди, но высвобождают медь в дестабилизирующих условиях быстрее, чем фермент WT.Измененная гибкость интрадимера у мутантов БАС может вызывать дифференциальное удержание металлов и способствовать определенным тенденциям агрегации, наблюдаемым для мутантных белков in vitro и у пациентов с БАС. Комбинированные биофизические и структурные результаты проверяют и связывают удержание меди с гипотезой дестабилизации каркаса как объединяющим общим механизмом как для агрегации SOD, так и для прогрессирования болезни ALS, с последствиями для тяжести заболевания и стратегий терапевтического вмешательства.

БАС — смертельное дегенеративное заболевание двигательной системы человека (1).Возможности для лучшего понимания и клинического вмешательства возникли после открытия, что до 23,5% семейных случаев БАС и 7% спонтанных случаев вызваны мутациями в гене супероксиддисмутазы 1 ( SOD1 ), кодирующем человеческий Cu, Zn SOD ( 2⇓ – 4). SOD представляет собой высококонсервативный (5) димерный антиоксидантный металлофермент, который детоксифицирует супероксидные радикалы (6, 7), но избыточной экспрессии мутантов SOD1 ALS достаточно, чтобы вызвать заболевание у мышей (8). Неправильно свернутые и / или агрегированные виды SOD откладываются внутри нейрональных и глиальных включений мыши (9, 10), даже до появления симптомов (11, 12).Хотя семейный БАС человека имеет симптоматический фенотип, неотличимый от спорадических случаев (13), отдельные мутации SOD1 и могут приводить к очень вариабельному прогрессированию заболевания и пенетрантности (14, 15).

Многие не общие механизмы, включая потерю активности или усиление функции, были постулированы для объяснения роли мутантов SOD в ALS (3, 16–19). Однако недавно первоначальная гипотеза, предполагающая, что SOD проявляет симптомы болезни за счет дестабилизации каркаса (нестабильность белка, вызванная структурными дефектами) и, как следствие, неправильной сборки и агрегации белков, получила новую поддержку (2, 10, 14, 20–23).По иронии судьбы, WT SOD является необычно стабильным белком (7, 24-26), и остается неясным, как именно мутации SOD вызывают заболевание. Напр., Человеческие SOD свободные остатки цистеина C6 и C111 участвуют в агрегации белков, способствуя перекрестному связыванию (27, 28) и / или изменениям стабильности, связанным с окислительными модификациями (29–33). Мутация химически активных тиолов значительно снижает скорость необратимой денатурации СОД человека и крупного рогатого скота (24, 34). Однако мутанты ALS на фоне C6A / C111S SOD (AS-SOD) (35, 36) сохраняют нативную дисульфидную связь C57 – C146, но все же могут подвергаться агрегации, а мутации свободных цистеинов могут вызывать ALS (37, 38).Эти результаты означают, что свободные цистеины не требуются строго, а скорее могут изменять кинетику агрегации (20). СОД также содержит два кофактора ионов металлов в каждой субъединице: каталитический ион меди (6) и структурно стабилизирующий ион цинка (34, 39, 40) (рис. 1 A ). У высших эукариот медный шаперон для SOD (CCS) играет важную роль в катализе как включения меди, так и образования нативных дисульфидных связей (41). Структурный анализ apo WT SOD указывает на большую гибкость или повышенную доступность растворителя для C6, который в противном случае был бы похоронен в стабильной границе раздела димеров (42, 43), а моделирование молекулярной динамики также предполагает критическую роль ионов металлов в структуре белка, поскольку β-слой SOD склонность снижается в отсутствие металлов (44).В результате апо СОД легко образует белковые агрегаты (45, 46), но молекулярные структуры агрегатов СОД, вероятно, полиморфны и представляют собой спорный вопрос (23, 47–51). Переплетенные эффекты повышающих агрегацию свободных цистеинов, димер-стабилизирующих ионов металлов и созревания СОД в CCS усложняют изучение самих мутаций SOD, вызывающих БАС, и, следовательно, четкая причинно-следственная связь остается неясной и требует деконволюции. .

Рис. 1.

Сравнение кристаллографической структуры и структуры раствора СОД WT и G93A.( A ) Общая архитектура димера SOD WT отображается в виде с поворотом на 90 °. G93 (маленькие красные сферы) располагается на открытой межцепочечной петле между пятой и шестой последовательными β-цепями SOD и, как ожидается, будет безвредным в обеспечении стабильности белка; тем не менее, этот сайт содержит наибольшее количество наблюдаемых замен, приводящих к БАС. G93 также удален как от ( верхний, ) интерфейса димера, так и ( нижний левый ) от активного сайта SOD (золотые и серебряные сферы), которые обычно участвуют в качестве основных детерминант стабильности SOD.Маленькие синие сферы обозначают свободные цистеины. ( Нижний правый ) Увеличенный вид сайта мутации (область в рамке в Нижний левый наклонен вперед) показывает высокое сходство между кристаллическими структурами SOD WT (фиолетовый) и G93A (красный) [коды ID банка данных белка 1PU0 ( WT) и 2ZKY (G93A)]. Указаны водородные связи, характерные для мотива β-выпуклости, при этом G93 (или A93) представляет положение 1. Карбонильная группа основной цепи β-цилиндрического остатка пробки L38 находится рядом с сайтом G93. ( B ) Полученные методом МУРР распределения электронной пары P ( r ) из образцов SOD WT (фиолетовый) и G93A (красный) в растворе сравниваются с теоретической кривой для 1PU0. P ( r ) участки нормированы на высоту пика. Неэмпирические модели WT SOD, полученные из данных P ( r ), изображены фиолетовым цветом с кристаллической структурой, прикрепленной к сетчатой ​​оболочке. Указаны вклады в основные и второстепенные пики от размеров субъединиц и димеров.

Чтобы лучше понять структурные эффекты мутаций ALS на архитектуру SOD, мы объединили богатство кристаллографических знаний о структуре SOD (7, 52, 53) с экспериментами по малоугловому рассеянию рентгеновских лучей (SAXS), чтобы охарактеризовать неправильную сборку агрегатов ALS. мутантные СОД в растворе.Более 20 лет назад мы решили первую атомную структуру человеческого белка SOD WT (рис. 1 A ) (20, 34) и предложили гипотезу дестабилизации каркаса, чтобы объяснить, как различные мутации, расположенные по всему β-стволу из 153 остатков фермент может вызывать сходный фенотип заболевания (2), хотя и с различиями в траектории прогрессирования. С тех пор ошеломляющее количество мутаций БАС было зарегистрировано у пациентов [178 (в основном миссенс) (54)] с аналогичным фенотипом у собак (55, 56).Технологии, основанные на решениях, все чаще применяются для связи структуры с биологическим результатом, например, путем изучения межмолекулярных взаимодействий в рамках активируемых стрессом путей (57, 58). SAXS, который может исследовать структуры для широкого диапазона размеров видов, также обеспечивает понимание с более высоким разрешением (59), например, по методам рассеяния видимого света, легко отличая развернутые белки от свернутых (60).

Здесь мы отслеживаем начальные события агрегации белков в подмножестве мутантов ALS, локализованных в мутационных горячих точках на glycine 93.В частности, мы хотели проверить возможную структурную основу того, как мутации G93 (A, C, D, R, S или V) модулируют возраст начала и клиническую тяжесть у пациентов с БАС (14, 15). Замена G93 происходит в области β-выступа (61) между последовательными β-цепями белка (рис. 1 A ) на выступающей петле примерно на 20 Å от T54, ближайшего остатка противоположной субъединицы, и металлсодержащий активный центр (рис. S1). Априори нельзя ожидать, что мутация этого положения внешней петли нарушит химию активного сайта или скрытые межмолекулярные интерфейсы.Однако мы обнаружили корреляцию кинетики зародышеобразования агрегации белков SOD с мутациями ALS в этом месте, стабилизирующие эффекты удержания ионов металлов и доступные данные для клинических фенотипов у пациентов с той же мутацией. Кроме того, измеряя и используя геометрию димера для наблюдения внутренних конформеров SOD, мы показываем, что мутантные белки G93 изначально проявляют повышенную внутридимерную конформационную гибкость в отсутствие агрегации, что может отражать повышенную тенденцию мутантов ALS становиться дефицитными по металлам и неправильно складываться. склонны и далее объясняют корреляцию с серьезностью заболевания.Таким образом, совокупные результаты по мутантам G93 подтверждают и расширяют гипотезу дестабилизации каркаса.

Результаты

Характеристика образцов SOD методом SAXS в физиологических условиях.

SAXS — это метод, который может надежно характеризовать форму, размер и структуру макромолекул в растворе, определяя их радиус вращения ( R г ), максимальный размер ( D max ) и оценки объема и гибкость (60). Мы использовали SAXS для создания платформы для эффективной классификации образцов SOD в растворе, сначала сосредоточив внимание на различении WT от мутантной SOD G93A.В растворе PBS эти белки структурно подобны, что отражает сравнение их соответствующих кристаллографических структур (рис. 1 и рис. S2). Экспериментальные данные МУРР для белков в растворе хорошо соответствуют смоделированным профилям МУРР для кристаллографической структуры димера WT, на что указывают низкие значения χ 2 , равные 1,1 и 1,2 для WT и G93A, соответственно (рис. S2). Образцы имеют сопоставимые значения R g (20,8 и 20,9 Å для WT и G93A SOD соответственно) и аналогичные максимальные размеры ( D max ; 66.5 Å и 69,5 Å для СОД WT и G93A соответственно). Незначительные отличия заметны в функциях распределения пар электронов P ( r ); однако в целом распределения в реальном пространстве аналогичны, и кристаллографический димер легко вписывается в ab initio модели электронной плотности, рассчитанные на основе данных рассеяния в естественных условиях (рис. 1 B ).

Анализ на основе SAXS определяет состояние агрегации мутантных белков SOD БАС.

В предыдущих исследованиях светорассеяния и ЭМ мы охарактеризовали дефекты мутантных SOD ALS, включая наиболее клинически агрессивную мутацию A4V, на фоне AS-SOD, в котором отсутствуют свободные цистеины (20), с использованием условий кислого буфера (pH 3.5), хелатирование металлов (1 мМ EDTA) и нагревание (37 ° C) для индукции образования агрегированных частиц. Для дальнейшего тестирования и расширения этих экспериментов на нативный свободный цистеин, содержащий мутантные SOD ALS, мы использовали высокопроизводительные эксперименты SAXS (62) для сравнения G93A SOD в истинном WT фоне с WT SOD (рис. S3). Как WT, так и G93A SOD легко образовывали большие агрегаты после 2-дневного инкубационного периода, на что указывало мутность образовавшихся растворов, а также крутые нисходящие наклоны при малом угле рассеяния ( q ) на полученных профилях SAXS.Однако при более коротком времени инкубации различия в степени агрегации были очевидны (рис. S3, средние кривые), что свидетельствует о дифференциальной кинетике агрегации. Кроме того, склонность G93A к агрегации была промежуточной между таковой у двух контролей, WT и A4V SOD, что соответствовало клинической тяжести заболевания, вызванного двумя мутациями.

Чтобы уловить виды SOD, образующиеся в процессе агрегации, мы провели аналогичные эксперименты в более мягких, более физиологических условиях, чем те, которые использовались ранее для мутантов на фоне AS-SOD (20).Мы инкубировали WT и G93A SOD при нейтральном pH в PBS, содержащем 10 мМ EDTA, при 37 ° C и записывали наблюдения SAXS в течение периодов времени от 5 до 30 часов (рис. 2). Из данных низкого рассеяния q мы наблюдали существенные различия в кинетике агрегации для этих образцов, которые были проиллюстрированы снижением линейности графиков Гинье для G93A по сравнению с WT (рис. 2 и 3, вверху справа, ). Например, после 30 ч инкубации затухание рассеяния заметно отличается в области низких значений q от такового для G93A, которое пропорционально ∼1 / q и характерно для стержневидных частиц, как видно для ансамблей XRCC4 с XRCC4-подобным фактором (63).Модифицированный график Гинье ( I × q по сравнению с q 2 ), обычно используемый для оценки R c (поперечное сечение R g стержневидных частиц) также явно демонстрирует линейность (рис. 3, посередине справа, ) и увеличенную длину стержня для мутанта, обозначенную спадом в нижнем диапазоне q (64). Кроме того, на графике Порода для G93A отсутствует плато, что указывает на гибкость мутанта в этих условиях (рис.3, Внизу справа ). В то время как WT SOD демонстрирует зависимость рассеяния ∼1 / q 4 в этой области, что свидетельствует о хорошо сложенной компактной частице, показатель Porod для G93A равен трем, что свидетельствует об уменьшении уплотнения или повышенной гибкости (65). Наконец, график распределения расстояний P ( r ) (рис. 3, левая вставка ) показывает, что обработка EDTA приводит к заметно увеличенной длине ( D max ) для агрегатов G93A.Эти наблюдения и измерения отражаются на электронных микрофотографиях агрегатов SOD G93A (рис. S4 C ).

Рис. 2.

SAXS отслеживает вызванную ЭДТА агрегацию белка SOD G93A в растворе. ( A ) Профили SAXS для мутантной SOD дикого типа и G93A в моменты времени после инкубации с 10 мМ EDTA. Интенсивности I ( q ) (ордината) отложены в произвольных единицах как функция угла рассеяния q (абсцисса). Данные представлены в виде графика степенного закона (логарифм – логарифм), чтобы выделить различия в области низких значений q , с последовательными временными точками, смещенными на 1 логарифм для ясности.( B ) Области Гинье ( Верхний ) WT и ( Нижний ) G93A дополнительно иллюстрируют изменения в поведении агрегации с течением времени (обозначенные увеличением цветового тона). Серые линии обозначают линейность, так что q × R g <1,3.

Рис. 3.

Сравнение результатов SAXS для обработанных EDTA образцов SOD WT и G93A после 30-часовой инкубации. Профили SAXS построены для SOD WT (фиолетовый) и G93A (красный) с осью и в качестве логарифмической шкалы.Серыми прямоугольниками обозначены области профиля интенсивности детектора I ( q ) по сравнению с профилем q , подвергнутые дополнительному анализу. Верхний правый и Средний правый — это графики Гинье для шаровидных и стержневидных частиц соответственно. Внизу справа — это график Порода, на котором плато при более высоких q указывает на компактную складчатость. Левая вставка — распределение в реальном пространстве P ( r ) для WT и G93A SOD.ЭДТА-индуцированное удлинение агрегата очевидно для G93A, но не для SOD дикого типа при сравнении с рис. 1 B .

Склонность к агрегации in vitro мутантных SOD G93 ALS отражает клинические фенотипы.

Установив надежные, но мягкие условия для индукции агрегации SOD, мы стремились охарактеризовать больший набор мутантов ALS в горячей точке G93. Мы выбрали площадку G93 по четырем основным причинам. ( 1 ) Шесть наследственных мутаций встречаются в глицине 93, и каждая, по-видимому, проявляется с отдельным клиническим фенотипом (14, 15), причем G93A (∼2–3 года между диагнозом и смертью), за которым следует G93V, являющийся наиболее агрессивным, G93S C и D являются наименее серьезными, а G93R — более вариабельными.( 2 ) Путем нацеливания на единственный сайт мы избегаем необходимости деконволюции результатов на основе мутационного положения и структурного контекста (т.е. рационализируя сравнения димерного интерфейса, связывания металла и / или поверхностных аминокислот). ( 3 ) Мутантный SOD G93A является одним из наиболее хорошо охарактеризованных и служит основой для некоторых из первых моделей болезни ALS. ( 4 ) Сайт расположен далеко от детерминант, участвующих в стабильности SOD (Рис. 1 A и Рис.S1), что делает его идеальным кандидатом для проверки гипотезы дестабилизации каркаса по сравнению с белками с мутациями на границе димеров или в местах расположения активных сайтов.

Для выявления различий между мутантными белками G93 SOD in vitro мы рекомбинантно получили все шесть мутантов G93 и SOD WT и ввели их в наш анализ агрегации на основе EDTA. В то время как через 5 часов инкубации после обработки 1 или 10 мМ ЭДТА, используемой для инициации агрегации, значительных изменений размера частиц не наблюдалось, заметные различия в размере частиц стали очевидны через 30 часов (рис.4 и рис. S5). Мы включили стратегию визуализации тепловой карты (66), чтобы всесторонне оценить различия в профилях SAXS этих видов высокопроизводительным способом (рис. 4 C ). Примечательно, что мы определили, что различия в агрегации коррелируют с клинической тяжестью мутаций (рис. 4 и рис. S5). Однако увеличение размера, отраженное увеличением значений R g , не сопровождалось пропорционально значительным увеличением R c в течение этого периода времени (рис.4 B и рис. S5), за исключением очень небольшого количества более крупных видов (обратите внимание на небольшую сигмоидальную форму на рис. 4 B ), что позволяет предположить, что все мутанты G93 в основном объединяются в стержни увеличивающейся длины (рис. S4 и S6) . Ab initio моделирование SAXS также предполагает, что линейные, стержневидные частицы доминируют в сигнале рассеяния. Для G93A, обработанного 10 мМ ЭДТА, через 30 часов с использованием 220-Å D max , реконструируется тело в форме змеи, которое сопоставимо по размеру с приблизительно четырехдимерной кристаллографической сборкой SOD с ориентированными β-нитями. перпендикулярно длинной оси, напоминает амилоидоподобную укладку (рис.5). Однако реакции агрегации, вероятно, протекают с образованием последовательных олигомеров. Таким образом, вероятный пул видов, сформированный в растворе, был смоделирован с использованием минимального ансамблевого анализа с использованием информации только с низким разрешением (для смягчения эффектов гибкости и конформационной гетерогенности) (67, 68). Эти результаты предполагают смесь линейных видов увеличивающейся длины (рис. S4 B ), которая отражает морфологию змеевидного тела.

Рис. 4.

Размер агрегата пропорционален условиям удаления металла и клиническому фенотипу продолжительности БАС для мутантов сайта G93.( A ) Степень агрегации мутантов G93, обработанных 0, 1 или 10 мМ ЭДТА в течение 30 часов, представлена ​​в таблице как радиус вращения в реальном пространстве, R г , который увеличивается с серьезностью заболевания, оцененной из опубликованных данные о мутациях пациента и обратное пространство R g поперечного сечения стержнеобразной частицы, R c , которое остается относительно постоянным первоначально на траектории агрегации. Мутанты сгруппированы и обозначены цветом в зависимости от тяжести заболевания у пациентов.G93D в концентрации 10 мМ EDTA не включали. ( B ) Среднее значение R г образовавшихся агрегатов наносится на график в сравнении со средним значением R c . Кружки большого, среднего и малого размера, имеющие цветовую кодировку, как в A , обозначают образцы, обработанные ЭДТА 10, 1 и 0 мМ соответственно. ( C ) Тепловая карта, полученная из профиля SAXS, в глобальном масштабе сравнивает образцы, обработанные 1 или 10 мМ EDTA (-1 или -10). Красные квадраты указывают на более высокую общую согласованность профилей SAXS, тогда как более светлые цвета подчеркивают различия.

Рис. 5.

Гипотетическая сборка агрегатов G93A, обработанных ЭДТА. Ab initio модель для образца G93A, обработанного 10 мМ EDTA, полученная из экспериментальных данных SAXS (с использованием оценки D max 220 Å), предполагает, что доминирующие частицы представляют собой удлиненные стержневидные частицы (красное твердое вещество) размером ∼ Толщина 1 субъединицы. Гипотетическая 8-субъединичная атомная модель, полученная из кристаллической структуры WT SOD (код 1PU0 банка данных белка), включает упаковочные элементы, чтобы подчеркнуть сходство формы и размера, и она показана рядом с твердотельной моделью для простоты сравнения.

Медь защищает мутанты БАС от агрегации, но по-разному удерживается в кислых условиях.

Чтобы определить факторы, которые влияют на фенотипы G93, мы проверили влияние включения ионов металлов, проанализировав содержание ионов металлов в наших образцах с помощью МС с индуктивно связанной плазмой (ICP-MS). Хотя все образцы, по-видимому, содержали стехиометрические уровни цинка 1: 1 на белочную субъединицу, более склонные к агрегации образцы очищались совместно с более низкими уровнями иона меди (Таблица S1).Дефицит меди соответствовал склонности мутантов к агрегации, вызванной ЭДТА, потому что размер образующихся видов обратно коррелировал с количеством связанной меди на 30-часовом снимке (рис. 6 A ).

Рис. 6.

Агрегационно-защитные эффекты включения меди для мутантов G93 и не зависящие от агрегации конформационные различия. ( A ) Степень агрегации варьирует для мутантных белков SOD G93, обработанных 1 (маленькие кружки) или 10 мМ (большие кружки) EDTA в течение 30 часов.Мутанты сгруппированы по результирующей клинической серьезности, которая указана на рис. 4. R г обратно пропорционален включению меди, при этом пунктирные линии соединяют образцы, обработанные данной концентрацией ЭДТА. ( B ) График степенного закона (логарифм – логарифм), где интенсивности (произвольные единицы) смещены на 1 логарифм для последовательных моментов времени, показывает влияние котрансляционной нагрузки меди на степень агрегации белка, вызванной ЭДТА. Низкие различия q заметны для мутантных образцов, полученных и выраженных в отсутствие CCS после 1 дня обработки EDTA (нижние графики).Напротив, для индукции дифференциальной агрегации CCS-коэкспрессированных белков SOD требуется продолжительная инкубация, и через 1 неделю SOD WT также претерпевает небольшую агрегацию (средние и верхние графики) (таблица S2). ( C ) Cu 2+ –Cu 2+ Внутридимерные расстояния, измеренные с помощью импульсной диполярной спектроскопии ЭПР, представлены как распределения расстояний P ( r ). Расширение пика, по-видимому, связано со склонностью к агрегации, подтверждая внутреннюю конформационную гетерогенность этих мутантов в отсутствие агрегации.( D ) Количественное определение C представлено как ширина пика на половине максимальной высоты пика.

Мутанты SOD часто очищают с помощью субстехиометрических количеств меди, и поэтому общая стратегия получения основана на восстановлении металлов в качестве конечной стадии очистки, что и было нашим первоначальным экспериментальным подходом. Учитывая важность дефицита меди для склонности к агрегации, мы хотели соответствующим образом отличить включение меди от удерживания меди. Поэтому мы проверили, была ли неспособность мутантов ALS к совместной очистке с достаточным количеством меди из-за их неспособности включать или удерживать медь, потому что эксперименты показали, что без надлежащих шаперонов соответствующие ионы металлов не всегда могут быть включены в их соответствующие ионы. позиции (69, 70).

Чтобы проверить влияние шаперона на включение меди, мы реализовали протокол очистки, основанный на коэкспрессии SOD с дрожжевым гомологом CCS (71). После этой процедуры мы измерили содержание меди с помощью ICP-MS для трех мутантов, которые представляют диапазон клинической степени тяжести и кинетику агрегации, изображенную на рис. 4 (наименее агрессивный: G93R, умеренно агрессивный: G93D, наиболее агрессивный: G93A), приготовленных в Система CCS. Мы обнаружили улучшенное включение меди, сравнимое с таковым для СОД дикого типа (~ 70–80%), для всех этих мутантных ферментов (Таблица S1).Чтобы охарактеризовать структуру вокруг парамагнитного центра Cu 2+ , эти образцы также были проанализированы методом непрерывной спектроскопии ЭПР, и между этими образцами не было замечено никаких существенных отличий от WT. Вместе эти результаты показывают, что мутанты G93 не препятствуют включению или удержанию меди в физиологических условиях и имеют локальные медные среды, подобные WT.

В связанных экспериментах мы исследовали удаление ионов металлов из образцов, нагруженных CCS / Cu 2+ , с использованием установленных процедур (72).Мы обнаружили, что количество остаточного металла, удерживаемого мутантными белками ALS, также, по-видимому, коррелирует с клинической тяжестью (Таблица S1). Мутант G93A удерживал меньше меди (12,5%) и цинка (28,7%), чем фермент WT (20,3% меди и 35% цинка). Таким образом, различия в способности мутантов ALS удерживать металлы стали очевидными во время возмущений, таких как диализ с низким pH для удаления или восстановления металлов.

В нашем анализе агрегации, индуцированной ЭДТА, образцы, нагруженные CCS / Cu 2+ , не смогли первоначально агрегироваться в мягких условиях, но продемонстрировали умеренную мутационно-специфическую агрегацию после продолжительной инкубации (рис.6 В ). После 1-недельной инкубации статус агрегации мутантов отличался от образца WT. Однако разница в размерах была менее резкой, чем для образцов, восстановленных металлом (таблицы S2 и S3), поскольку известно, что WT SOD агрегирует при длительном возмущении (20). Динамическое рассеяние света (DLS) также использовалось для измерения радиусов гидратации ( R h ) для этих образцов (Таблица S2), выявив один преобладающий пик (≥99,4% массы) в диапазоне размеров от 40 до 50 Å. для образцов и, следовательно, подтверждая результаты SAXS.

Чтобы выяснить дополнительные аспекты гибкости димера, которые могут объяснить изменчивость, связанную с сайтом G93, мы использовали эксперименты с четырехимпульсным двойным электронно-электронным резонансом (DEER), используя парамагнитный спин Cu 2+ для получения Cu 2+ –Cu 2+ расстояния между соседними субъединицами (Рис. 6 C и Рис. S7). Первоначальные эксперименты показали, что время релаксации G93A было значительно быстрее (~ 1 мкс), чем время релаксации мутантов WT SOD или G93R (~ 2-3 мкс), что потребовало дейтерирования G93A для воспроизводимых измерений ESR.Тем не менее, полученные в результате распределения расстояний Cu 2+ обнаруживают относительно постоянный пик при ∼32–33 Å для всех тестированных мутантов ALS, что согласуется с разделением медь-медь ∼32 Å в кристаллографических структурах. Однако широта распределения была значительно шире для мутантов (фиг. 6 D ), что предполагает повышенную гибкость димера и / или доступность динамических конформаций для этих мутантов ALS SOD в отсутствие агрегации.

Обсуждение

SAXS включает мониторинг агрегации мутантов ALS SOD.

Связь агрегации белков с нейродегенеративными заболеваниями и природа образующихся агрегатов являются важными и противоречивыми вопросами. Мутантные белки SOD образуют агрегаты в нейронах и глии пациентов с БАС и в тканях мышей, моделирующих заболевание, даже до появления симптомов заболевания (10, 12, 73), но природа агрегатов и основа для склонности к агрегации спорны. Чтобы охарактеризовать склонность к агрегации SOD in vitro, мы разработали инновационный анализ на основе SAXS и показатели для наблюдения различий между мутантами SOD дикого типа и G93 ALS (рис.2, 3, 4 и 5 и рис. S3 и S5). Из многих мутантов БАС мы выбрали горячую точку G93 специально из-за ее дистального расположения по отношению к стабилизирующим факторам (рис. 1 A и рис. S1), различной клинической тяжести среди мутантов и для упрощения интерпретации данных. Поскольку СОД находится преимущественно в цитозоле, мы инкубировали наши образцы с низкими концентрациями восстанавливающего агента, что устраняет осложнения, возникающие из-за модификаций свободного цистеина, вместо использования фона AS-SOD.Мы также стремились избежать артефактов из-за суровых нефизиологических условий агрегации. Клеточные хелаторы поддерживают низкие концентрации цитозольных ионов металлов при аттомолярной свободной меди (74) и пикомолярном свободном цинке (75), что отражает очевидное сродство связывания WT SOD с медью и цинком (низкое аттомолярное и сотни пикомолярных, соответственно) (76). Следовательно, потеря ионов металлов при низких и средних микромолярных концентрациях субъединиц SOD (77), вероятно, будет необратимой, и, следовательно, наше лечение ЭДТА in vitro имитирует потерю клеточного металла.В целом, наши измерения неагрегированных видов SOD проверяют и поддерживают предыдущие исследования на основе SAXS, описывающие общую форму мутантных SOD дикого типа и БАС в физиологических условиях (25, 78, 79), но мы расширили эти анализы, дополнительно отслеживая изменения агрегации белков в решение. Размеры и форма видов, наблюдаемых в наших экспериментах, согласуются с растворимыми, неродными агрегатами, распознаваемыми антителом против неправильно свернутой ALS SOD (80). SAXS обеспечивает надежную экспериментальную основу для оценки сборки белков в филаменты в растворе, что наблюдается для комплексов репарации разрывов дцДНК (63).Судя по особенностям более низкого и высокого разрешения в наших профилях SAXS, агрегация является результатом, прежде всего, изменений в состоянии олигомеризации, а не глобально аберрантного сворачивания или разворачивания.

Дестабилизация каркаса, площадка G93 и эффекты ионов металлов.

Важность белкового каркаса в контроле активности кофактора — это общий вопрос биохимии, который часто трудно исследовать количественно. WT SOD — это сверхстабильный белок, который иногда очищают как активный белок с помощью таких экстремальных методов, как кипячение и органическая экстракция (26), и чрезвычайная специфичность упаковки и взаимодействий, лежащих в основе этой необычной стабильности, которая контролирует доступность и активность кофактора ионов металлов, может сделать белок более подвержен влиянию мутации (26).Кроме того, ион меди является подвижным для окислительно-восстановительного цикла во время катализа (25), и, таким образом, активный центр должен быть точно настроен, чтобы различать субстраты, промежуточные соединения и продукты, которые отличаются только одним электроном. Сайт G93 находится на противоположном конце β-цилиндра от активного центра, ∼19 Å от иона меди и ∼24 Å от иона цинка (рис. S1 A ). Этот сайт мутации, следовательно, особенно подходит для проверки идеи, что нарушение компактного каркаса SOD может влиять на сайты ионов металла, даже для отдаленных мутаций.Поразительно, но мы обнаружили, что возмущения, которые снижают стабильность каркаса, могут при правильных обстоятельствах приводить к усиленной дестабилизации белков, которая ускоряет агрегацию (Рис. 7).

Рис. 7.

Модель дестабилизации каркаса для агрегации мутанта G93. ( Left ) Хотя G93 (золотые звезды) мутанты ALS SOD имеют сходные общие структуры относительно WT SOD, большинство мутантов демонстрируют повышенную конформационную гибкость (Рис. 6). Эта особенность делает их более подверженными последствиям вторичных событий, таких как потеря металла (кружки) в условиях стресса или дисомеостаза (например, при низком pH или лечении ЭДТА).Со временем это может привести к локальному разворачиванию или другим особенностям потери каркаса и структурной целостности, что приводит к агрегации, в результате чего наиболее агрессивные мутанты будут демонстрировать повышенную кинетику агрегации, как показано на схеме кривой SAXS. Это различное поведение агрегации, в свою очередь, может клинически проявляться в виде переменной продолжительности заболевания. Для всех мутантов G93, исследованных в этих условиях, фенотип сходен, но время варьируется. Профили SAXS представляют собой данные мутанта G93, обработанного 1 мМ EDTA, из фиг.S5 построен как график степенного закона (логарифм – логарифм) с интенсивностями по оси y (произвольные единицы), смещенными на 1 логарифм для каждого образца для ясности.

Ионы металлов в СОД образуют неотъемлемую часть его структурного каркаса, при этом лигирование Cu 2+ связывает различные структурные элементы, а лигирование Zn 2+ организует петлю Zn (5, 39, 53). Таким образом, дефицит металла снижает стабильность СОД (81). СОД, не содержащая меди, имеет слегка различимую структуру (42, 43), а виды СОД с дефицитом металлов также имеют более быструю кинетику разворачивания, чем голопротеин (82).Следовательно, апо-СОД способна образовывать аберрантные олигомеры и агрегаты, которые, как предполагается, возникают через мономерный интермедиат (45, 83, 84). Примечательно, что Cu 2+ кажется более важным, чем Zn 2+ для кинетической стабилизации СОД (82), а для гомолога крупного рогатого скота Cu 2+ также более важен для придания термодинамической стабильности (85). Развертывание мутантов БАС кажется отличным от такового при СОД дикого типа из-за преимущественной тенденции мутантов высвобождать медь на первом этапе (86), а мутанты БАС сохраняют меньше меди, чем их аналоги дикого типа, в исследованиях сверхэкспрессии в культуре клеток (87).Кроме того, улучшенная загрузка меди у мышей модели БАС была связана с улучшением выживаемости и двигательной функции (88). Эти результаты подчеркивают, что сайт меди является центральным, критическим элементом, энергетически связанным с общей структурой белка (Fig. S1 B ).

Мутанты ALS, продуцируемые в рекомбинантных системах экспрессии, имеют тенденцию к дефициту меди, а иногда и цинка, даже при добавлении металлов в питательную среду (89). Интересно, что мутанты G93 с большей тяжестью заболевания, экспрессируемые в нашей системе экспрессии без шаперонов, имели тенденцию к совместной очистке с меньшим количеством меди после диализа с ЭДТА при низком pH (Таблица S1).Некоторые мутанты БАС могут иметь пониженную аффинность связывания с медью и цинком (76) и не могут легко реметаллировать (90). Тем не менее, мы обнаружили, что любое возможное снижение сродства связывания для мутантов G93 может быть преодолено совместной сверхэкспрессией дрожжевого CCS. In vivo эндогенный CCS человека действует ферментативно и экспрессируется в нейронах на уровне до 30 раз ниже, чем SOD (91), но CCS обнаруживается в белковых агрегатах пациентов с ALS (92, 93). Шаперон также может усугублять фенотип заболевания у трансгенных мышей, экспрессирующих G93A (94), но различные эффекты наблюдаются для других мутантов (95).Хотя неясно, приводят ли мутации БАС к какой-либо аберрантной химии CCS или взаимодействиям in vivo, генетическая делеция мышиного CCS у модельных мышей БАС не повлияла на тяжесть или прогрессирование заболевания (96). Важно отметить, что правильное включение металлов в мутантные SOD ALS, обеспечиваемые CCS, улучшает стабильность, но не препятствует агрегации в неблагоприятных условиях (Fig. 6 B ).

Наши эксперименты по СОЭ указывают на различия между мутантами БАС и СОД дикого типа при отсутствии агрегации.Эти различия характерны для окисленного голопротеина, а не просто для дестабилизированных, частично металлизированных форм, потому что только расстояния Cu 2+ –Cu 2+ (а не Cu 1+ –Cu 1+ ) наблюдаются диапазон от 10 до 80 Å. Предыдущие исследования дейтериевого обмена ЯМР показали, что металл-связывающая область SOD демонстрирует повышенный обмен у мутанта G93A (97). Мы отметили различия в общей ширине межсубъединичного пика для нескольких мутантов G93 (рис. 6 C и D ), и в связанных работах было высказано предположение, что эта особенность является общей для дополнительных мутантов ALS (98).Вероятно, эта гибкость может позволить увеличить конформационный отбор образцов, делая мутантные белки SOD более восприимчивыми к потере и агрегации металлов. Таким образом, наши и другие данные подтверждают модель, в которой дестабилизация мутантов ALS, таких как G93A, приводит к повышенной динамике, которая может влиять на металлизацию и, таким образом, на состояние сборки.

Связь с болезнями.

Чтобы преодолеть огромный разрыв между структурной биохимией белков и человеческими заболеваниями, важно изучить четко определенные системы, такие как сайт с одной мутацией с различными исходами заболевания, чтобы выявить потенциально полезные корреляции.Мы обнаружили, что белки ALS SOD с мутациями в сайте G93 агрегированы пропорционально как их дефициту меди, так и тяжести клинической продолжительности (15) (рис. 6 A ). Хотя небольшой размер выборки некоторых генотипов (14) усложняет статистический анализ, и здесь рассматривается только один показатель, мы нашли аналогичные результаты для A4V (рис. S3). Корреляционные исследования проводились ранее. Например, в клетках HEK293FT сверхэкспрессированные мутанты ALS, которые диктуют быстрое прогрессирование заболевания, имеют тенденцию к более высокой склонности к агрегации, но мутанты с низким потенциалом агрегации, как предполагалось, непредсказуемы клинически (99).Однако исследования мутантов БАС на фоне AS-SOD не смогли найти корреляции с тяжестью заболевания (100). Другие, однако, обнаружили корреляцию между продолжительностью заболевания и стабильностью белка для незаряженных мутантных SOD по БАС, но отметили, что водородные связи и электростатика могут иметь решающее значение при определении выбросов (101). Stathopulos et al. (46) обнаружили, что мутанты апо G93 менее стабильны, чем их голо-аналоги, и подтверждая наши наблюдения, отметили, что мутанты G93S и G93R были наиболее WT-подобными в пределах набора.

В сочетании с известной структурной биохимией SOD, представленные здесь коллективные результаты подтверждают и расширяют прогноз, что мутации, дестабилизирующие каркас, будут увеличивать склонность к агрегации. Более того, наши результаты доказывают, что склонность к агрегации во многих случаях будет положительно коррелировать с тяжестью болезни БАС. Медный сайт обеспечивает стабилизирующие каркас взаимодействия между основными структурными элементами белка, соединяя β-бочку с дисульфидной петлей (которая вносит вклад в интерфейс димера) и цинковой петлей (которая стабилизирует субъединицу) (рис.S1 B ) (5, 53). Следовательно, связывание ионов меди способствует стабильности, а потеря ионов меди сильно дестабилизирует сборку нативного димера.

Однако потеря меди может быть не единственным результатом дестабилизации каркаса. Повышенная конформационная гибкость у мутантов БАС (например, наблюдаемая в наших экспериментах с СОЭ) может привести к нескольким вторичным последствиям в условиях дисомеостаза (включая потерю металла), что, таким образом, будет диктовать и способствовать неправильной укладке и агрегации мутант-специфическим образом, что приводит к к сходному фенотипу (агрегации), но с разной кинетикой (рис.7). Наша гипотеза, таким образом, также охватывает аспекты гипотезы окислительного повреждения, которая подразумевает, что активные формы кислорода в высоко метаболических нейронах подвергают СОД риску окислительного повреждения; это наблюдалось для опосредованного перекисью водорода окислительного повреждения гистидиновых лигандов активного центра, приводящего к высвобождению ионов меди (102). Кроме того, слегка дестабилизированные мутантные белки могут быть более чувствительными к эффектам окислительной модификации, такой как глутатионилирование (103), что приводит к их диссоциации и неправильной укладке.Гипотеза дестабилизации также предсказывает, что потеря Zn (39) и мутации ALS, введенные в ковалентно связанные димеры SOD, такие как те, которые ранее были разработаны для увеличения периода полужизни SOD в сыворотке (104), будут способствовать увеличению заболеваемости в моделях ALS на животных. Таким образом, размещение наших биофизических результатов в контексте структурной биохимии СОД обеспечивает основу для единой механистической гипотезы, которая делает конкретные проверяемые прогнозы для распространения болезни и вмешательства.

Резюме и перспективы.

С тех пор, как была предложена гипотеза дестабилизации каркаса (2, 20), тем не менее, многие исследования были направлены на проверку корреляций между индивидуальными или коллективными мутациями SOD БАС и усилением токсических функций. Однако, вместо того, чтобы указывать на явную активность увеличения функции, эти результаты предполагают общую потерю функциональной стабильности на основе структуры из-за прямой вызванной мутацией дестабилизации белкового каркаса и упаковки или косвенной дестабилизации через потерю ионов меди для некоторого активного сайта. мутации.Последующие эффекты структурной дезинтеграции указывают на потерю ионов меди, потерю ионов цинка, окислительные модификации, дестабилизацию границы раздела димеров и неправильную сборку, ведущую к агрегации / филаментации. Этот тест и расширение гипотезы дестабилизации каркаса, которая конкретно связывает дестабилизацию складки и сборки SOD с уменьшением связывания ионов меди, может объяснить, почему дестабилизирующие мутанты Cu, Zn SOD способствуют развитию ALS, тогда как мутации тетрамерной α-β-складки Mn SOD очевидно, нет (105).

С помощью этого анализа на основе SAXS мы смогли охарактеризовать размер и форму агрегатов мутантного белка SOD ALS и в совокупности связать потерю ионов металлов, гибкость, дестабилизацию и склонность к агрегации белков SOD ALS с серьезностью заболевания. Хотя наши результаты не доказывают, что патофизиология у пациентов с БАС с мутациями SOD напрямую связана с дестабилизацией и агрегацией SOD, показанные здесь корреляции с клинической тяжестью поразительны и подтверждают стратегии стабилизации белка SOD в качестве возможных вмешательств при заболевании, по крайней мере, для подгруппы пациентов. .Эти открытия и идеи о фатальном нейродегенеративном заболевании, кроме того, имеют отношение к выяснению общей структурной биохимии и значимости металлов в патофизиологии, лежащей в основе многих нейродегенеративных заболеваний, которые связаны со склонностью к агрегации белков.

Материалы и методы

Конструирование плазмид и получение белков.

Мутации были введены в кодирующую последовательность SOD с использованием олигонуклеотидов от Integrated DNA Technologies и QuikChange II Kit (Agilent).Cu, Zn SOD человека дикого типа и его варианты ALS экспрессировали без шаперона, как описано ранее (20), с небольшими изменениями, как описано в SI Materials and Methods . Плазмида, кодирующая WT SOD, коэкспрессируемая с дрожжевым CCS, была подарком от Лены Тибелл (Университет Линчёпинга, Линчёпинг, Швеция), и эти образцы были приготовлены, как описано (71), с небольшими изменениями, как предусмотрено в SI Materials and Methods .

Анализ белков, анализ металлов и условия агрегации.

После очистки активность белка проверяли с помощью анализа на основе геля, как описано (20, 106), а включение металлов оценивали с помощью ICP-MS, как описано ранее (107), с небольшими модификациями. Агрегацию вызывали заменой буфера образцов SOD с концентрацией 2 мг / мл на PBS с или без 1 или 10 мМ EDTA (pH 8) и инкубацией образцов и буферов в течение ≥24 ч при 37 ° C. Дополнительная информация представлена ​​в SI «Материалы и методы» .

DLS.

Образцы объемом 30 микролитров помещали в 384-луночный планшет DLS с прозрачным дном и измеряли с помощью прибора DynaPro Plate Reader DLS (Wyatt Technologies).Дополнительная информация представлена ​​в SI «Материалы и методы» .

SAXS и графический анализ.

Эксперименты SAXS проводились на канале Structurally Integrated Biology for Life Sciences 12.3.1 в Advanced Light Source (62, 108). Данные собирали для образцов объемом 15-20 мкл с концентрацией 2 мг / мл в PBS, содержащем 1 мМ β-меркаптоэтанол или 0,25 мМ трис- (2-карбоксиэтил) фосфин (с ЭДТА или без него) при 16 ° C с использованием MAR CCD 165. детектор. Дополнительная информация представлена ​​в SI «Материалы и методы» .

ЭМ.

G93A SOD агрегаты получали и визуализировали с использованием ЭМ с отрицательной пропускающей способностью, как описано в SI «Материалы и методы» .

ОЛЕНЬ.

DEER эксперименты проводились на специально разработанном спектрометре ЭПР с двумерным преобразованием Фурье (109). Дополнительная информация представлена ​​в SI «Материалы и методы» .

Благодарности

Мы благодарим Джеффа Спира, Шона Маллигана, Бриджит Каррагер и Клинта Поттера за помощь с EM; Михалу Хаммелю, Брайану Чападосу и Грегори Хура за советы / знания в области SAXS; Чихару Хитоми и Камиллу Шварц за техническую помощь / знания; Сунила Кумару за помощь в анализе металлов; Саманта Зейтлин, Робин Ганн, Джон Кристи и Коллин Дайер за критическое прочтение рукописи; Лене Тибелл за предоставление плазмиды коэкспрессии CCS; а также Роберту Хэллювеллу, Джудит Кампизи, Лизе Эллерби, Яну Макрей и Джозефу Бонавентуре за ценные советы.Данные SAXS были собраны на канале «Структурно интегрированная биология для наук о жизни» с помощью программы «Технологии интегрированного дифракционного анализа», поддерживаемой Управлением биологических и экологических исследований Министерства энергетики США. Данные ESR были собраны в Национальном биомедицинском центре Advanced Electron Spin Resonance Technology (ACERT). Данные ЭМ передачи были собраны в Национальном ресурсе автоматизированной молекулярной микроскопии (NRAMM), который поддерживается грантом 2P41RR017573 Национального института здоровья (NIH) Национального центра исследовательских ресурсов (NCRR) и грантом 9P41GM103310 Национального института здравоохранения США. Медицинские науки (НИГМС).Эта работа была поддержана грантами NIH R01GM039345 (для E.D.G. и J.A.T.) и R01GM066775 (для B.R.C.), грантом NIH / NIGMS P41GM103521 [для J.H.F. (ACERT)] и NIH / NCRR Grant P41RR016292 [J.H.F. (АСЕРТ)]. G.E.M. был поддержан учебным грантом NIH по молекулярной биофизике T32GM008267. A.J.P. выражает признательность за следующую поддержку: Программа стипендий для аспирантов Национального научного фонда [в Исследовательском институте Скриппса (TSRI)], фонды докторской степени Института химической биологии Скаггса (в TSRI) и грант NIH / Национального института по проблемам старения на постдокторскую подготовку T32AG000266 в Фундаментальные исследования старения и возрастных заболеваний (в Национальной лаборатории Лоуренса Беркли), спонсируемые Институтом исследований старения Бака.

Сноски

  • Вклад авторов: A.J.P., D.S.S., G.E.M., R.P.R., B.R.C., J.A.T. и E.D.G. спланированное исследование; A.J.P., D.S.S., G.E.M., W.A.L., K.N.D. и P.P.B. проведенное исследование; R.P.R., P.P.B., F.L.P., M.W.W.A. и J.H.F. внесены новые реагенты / аналитические инструменты; A.J.P., D.S.S., G.E.M., R.P.R., W.A.L., P.P.B., M.W.W.A., J.H.F., B.R.C., J.A.T. и E.D.G. проанализированные данные; и A.J.P., D.S.S., J.A.T. и E.D.G. написал газету.

  • Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

  • ↵ * Для этой статьи, отправленной через прямое представление, был назначен редактор.

  • Эта статья содержит вспомогательную информацию на сайте www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1308531111/-/DCSupplemental.

Антитело против SRF (G93)

Название продукта

Антитело против SRF (G93)

Посмотреть все продукты SRF фактора ответа сыворотки

Артикул / Каталожный номер

A00557

Размер

100ул

Форма

Жидкость

Описание

Антитела

Boster Bio Anti-SRF (G93), каталожный номер A00557.Проверено в приложениях IHC, WB. Это антитело реагирует с человеком, мышью, крысой.

Хранение и обращение

Хранить при -20 ° C в течение одного года. Для кратковременного хранения и частого использования хранить при температуре 4 ° C до одного месяца. Избегайте повторяющихся циклов замораживания-оттаивания.

Процитировать этот продукт

Антитело против SRF (G93) (Boster Biological Technology, Плезантон, Калифорния, США, Каталожный № A00557)

Хост

Кролик

Содержание

Кроличий IgG, 1 мг / мл в PBS с 0.02% азид натрия, 50% глицерин, pH 7,2

Клональность

Поликлональный

Реактивные частицы

A00557 реагирует на SRF у человека, мыши, крысы

Приложения

A00557 имеет гарантию IHC, WB Boster Guarantee

* Блокирующий пептид можно купить по цене 150 долларов США. Для получения более подробной информации свяжитесь с нами.

Проверка антител

Boster проверяет все антитела с помощью WB, IHC, ICC, иммунофлуоресценции и ELISA с известными положительными и отрицательными образцами для обеспечения специфичности и высокой аффинности.

Подробнее

Награда ученых-новаторов

Если вы первым просматриваете этот продукт, или если у вас есть результаты для особого образца, вида или приложения, в котором этот продукт не прошел валидацию, поделитесь своими результатами с нами и получите следующий набор антител / ELISA бесплатно! Применимо ко всем ученым во всем мире.

Отправить обзор

Yokohama Geolandar G93 Обзор и рейтинг шин

Используемая в основном в качестве оригинального оборудования на таких автомобилях, как Suzuki Grand Vitara, Yokohama Geolandar G93 обеспечивает всесезонную тягу с комфортабельными ходовыми качествами.Следует отметить, что G93 также можно использовать в качестве сменной шины для грузовиков и внедорожников, в которых используется установка 225 / 65R17.

Всесезонная смесь протектора сочетается с более агрессивным рисунком протектора с 5 ребрами, который имеет сплошное зигзагообразное центральное ребро для повышенной управляемости, что является плюсом для этой шины.

Сцепление на мокром асфальте улучшено за счет четырех окружных канавок, диагональных канавок и дополнительных ламелей вокруг протектора. Это также снижает риск аквапланирования в стоячей воде.Добавление ламелей дополнительно помогает сцеплению на легких заснеженных дорогах, что в целом неплохо, хотя это ни в коем случае не зимняя шина.

Рисунок протектора с 5 ребрами разработан для снижения дорожного шума и обеспечения более плавного движения по шоссе, но, к сожалению, мы считаем, что шум можно было бы еще больше снизить. Рейтинг 280 UTQG дает повод для беспокойства по поводу срока службы протектора, который мы обсуждаем далее в наших общих размышлениях. Yokohama предоставляет ограниченную гарантию на протектор Geolandar G93.

Плюсы

  • Сцепление на сухой и мокрой дороге
  • Зимние характеристики лучше, чем у многих в своем классе
  • Комфортная езда

Минусы

  • Низкий срок службы протектора
  • Снижение дорожного шума

000 В целом Мысли 9000 В целом

Yokohama широко известна производством одних из лучших шин, продаваемых сегодня, однако мы считаем, что G93 к их числу не относится. Да, уровень сцепления на сухой / мокрой дороге более чем достаточен, а характеристики на умеренном снегу не так плохи, как у многих в этом классе.

Нельзя упускать из виду низкий срок службы протектора, что в значительной степени само собой разумеющееся, учитывая рейтинг 280 UTQG. Мы слышали, как водители упоминали об уменьшении пробега протектора намного меньше, чем ожидалось, а некоторые утверждали, что этого хватило менее чем на 30 000 миль. Кроме того, более агрессивный рисунок протектора увеличивает дорожный шум на скоростях шоссе.

В целом, мы оцениваем G93 как нижнюю часть всесезонного класса для шоссе и не рекомендуем его в качестве модели на замену. Другие шины, такие как Yokohama YK-HTX, Michelin Defender LTX M / S и Cooper Discoverer HTP, среди прочих, станут гораздо лучшим выбором.

Щелкните здесь, чтобы увидеть текущие купоны Yokohama

Щелкните здесь, чтобы узнать текущую цену

На какие автомобили подойдет Yokohama G93?

(Это не полный список ВСЕХ автомобилей, на которые подойдет эта шина)

Размеры шин

17 ″

P225 / 65R17 100H BSW

Диапазон цен

Диапазон цен на Yokarohama примерно от 213 долларов и выше. Вы также можете найти периодические скидки, скидки, купоны и специальные предложения на эту шину.

Щелкните здесь, чтобы узнать текущие цены на все размеры шин Yokohama Geolandar G93

Гарантия

Yokohama предоставляет ограниченную гарантию на протектор Geolandar G93.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *